СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОЛЛАГЕНАЗЫ Российский патент 1995 года по МПК C12N9/48 C12N9/64 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к препаративной биохимии, и используется для получения очищенной коллагеназы животного происхождения, которая находит применение в клеточной биотехнологии, меховой и кожевенной промышленности, парфюмерии, ветеринарии и медицине, в научно-исследовательской работе.

Известен способ получения коллагеназы, который заключается в выделении фермента из гепатопанкреаса краба Uca pugilator с помощью гомогенизации ткани в 10 объемах ацетона при -20^оС, обработке осадка 10 объемами н-бутанола, затем 10 объемами ацетона при -20^оС, после чего проводились сушка, растворение порошкообразного препарата, центрифугирование, осаждение из раствора фермента сульфатом аммония (70% от насыщения) при 0^оС, гельфильтрация на сефадексе G 150, ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе, хроматография на гидроксилапатите и повторная гель-фильтрация на сефадексе G75. Все хроматографические операции проводились при 4^оС. В результате получен гомогенный препарат коллагеназы с удельной активностью 4020 единиц на 1 мг белка [1]
Недостатком данного метода является его многостадийность, применение в больших количествах органических растворителей, являющихся взрывоопасными (например ацетон, температура вспышки которого равна -18^оС) и экологически грязными, а также необходимость создания низких температур на первых стадиях выделения коллагеназы.

Наиболее близким к предложенному по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ, предусматривающий выделение фермента из гепатопанкреаса промысловых крабов с помощью гомогенизации ткани в буферных водных растворах с рН 6-9,5, содержащих неионный детергент в количестве 0,1-5% и 0,1-2,0 М хлорида щелочного металла, после чего последовательно проводились микрофильтрация и ультрафильтрация с лимитом пропускания 5000 Да. В результате получен препарат коллагеназы с удельной активностью не ниже 10000 единиц на 1 мг белка [2]
Известный способ позволяет получать коллагеназу краба без применения органических растворителей, что является большим биотехнологическим достижением, все же и он не лишен серьезных недостатков. Так, в способе используются высокие концентрации поверхностно-активных веществ (неионный детергент) и солей (хлориды щелочных металлов), веществ, способных разрушить экологическое равновесие окружающей среды. Применение же очистных сооружений приведет к резкому удорожанию процесса выделения колагеназы. Другим серьезным недостатком является отсутствие стадии удаления липидов, содержание которых в гепатопанкреасе крабов очень высокое. Это существенно сказывается на стабильности конечного продукта из-за окисления липидов и эффективности проведения ультрафильтрации, так как рабочие мембраны быстро выходят из строя. Кроме того, последовательное проведение микрофильтрации и ультрафильтрации с лимитом пропускания 5 кДа позволяет отделять коллагеназу лишь от надмолекулярных высокомолекулярных агрегатов и низкомолекулярных веществ. Невелика и скорость ультрафильтрации на мембранах с пределом пропускания 5 кДа.

Целью изобретения является повышение качества целевого продукта и упрощение процесса.

Это достигается тем, что замороженный гепатопанкреас крабов помещают в слабощелочной забуференный раствор и инкубируют при перемешивании в течение 2-8 ч при температуре 0-30^оС до полной гомогенизации гепатопанкреаса. Для удаления липидов к полученному раствору при интенсивном перемешивании добавляют раствор хитозана, рН 2,0-6,5, доводя его конечную концентрацию до 0,01-0,4% Образовавшийся нерастворимый материал отделяют, а полученный раствор подвергают ультрафильтрации, отделяя сначала примесные вещества с мол. м. 100 КДа и выше, а затем примесные вещества с мол.м. 30 КДа и ниже. Раствор, содержащий ферментативную активность, лиофилизуют. Все операции проводят при температуре выше 0^оС. Удельная активность коллагеназы достигает 9800-11200 ед. на 1 мг белка. Целевой продукт не содержит липидов.

В предложенном способе удается отделить раствор от сопутствующих липидов и белков с мол. весом выше 100000 и ниже 30000, что приводит к более полному удалению примесных белков, а также изъять из процесса экологически грязные органические и неорганические соединения. Упрощение также достигается применением серийно выпускаемого оборудования для ультрафильтрации, что позволяет полностью автоматизировать весь технологический процесс.

Нижняя граница концентрации хитозана обусловлена тем, что при концентрации ниже 0,01% резко падает его флокулирующая способность, и в результате этого происходит лишь незначительное удаление примесных соединений из раствора фермента.

Верхняя граница концентрации хитозана обусловлена тем, что при концентрации выше 0,4% наблюдается агрегация молекул хитозана, которые не обладают флокулирующими свойствами и, соответственно их применение не приводит к очистке колагеназы.

Нижняя граница рН раствора хитозана обусловлена тем, что после добавления в раствор фермента хитозана с рН ниже 2,0 наблюдается инактивация коллагеназы.

Верхняя граница рН раствора хитозана обусловлена тем, что хитозан при рН выше 6,5 слаборастворим.

Нижняя граница температуры процесса гомогенизации определяется тем, что при температуре ниже 0^оС водные растворы замерзают.

Верхняя граница температуры процесса гомогенизации определяется тем, что при температуре выше 30^оС в данных условиях начинается наблюдаться инактивация коллагеназы краба.

Указанное время гомогенизации (2-8 ч) является минимальным временем, необходимым для полного растворения ткани, которое в свою очередь зависит от температуры процесса (при более низкой температуре необходимо вести дольше процесс, а при более высокой температуре гомогенизация заканчивается раньше). Сокращение времени гомогенизации приводит к неполному переходу фермента в раствор.

Выбор мембраны для ультрафильтрации на первой стадии, отсекающей вещества с мол. м. 100 кДа и выше, обусловлен тем, что эта мембрана, задерживая примесные соединения, совершенно не задерживает коллагеназу краба, в то время как доступные в настоящее время мембраны с меньшим диаметром пор (отсекают вещества с мол.м. 50 или 40 кДа) частично задерживают коллагеназу краба. Мембраны с промежуточными диаметрами пор не выпускаются.

Выбор мембраны для ультрафильтрации на второй стадии, отсекающей вещества с мол.м. 30 КДа и ниже, обусловлен тем, что эта мембрана, не задерживая примесные соединения, полностью задерживает коллагеназу краба, в то время как доступные в настоящее время мембраны с большим диаметром пор (отсекают вещества с мол.м. 50 или 40 кДа) часть коллагеназы задерживают, а часть пропускают. Мембраны с промежуточными диаметрами пор не выпускаются.

П р и м е р 1. 10 кг гепатопанкреаса камчатского краба помещают в 30 л забуференного трисом раствора рН 8,0 и инкубируют при перемешивании в течение 2 ч при температуре 30^оС до полной гомогенизации гепатопанкреаса. К полученному раствору при интенсивном перемешивании добавляют раствор хитозана рН 5,5, доводя его конечную концентрацию до 0,2% Образовавшийся нерастворимый материал отделяют, а полученный раствор подвергают ультрафильтрации, отделяя сначала примесные вещества с мол.м. выше 100 кДа, а затем примесные вещества с мол.м. ниже 30 кДа. Раствор, содержащий ферментативную активность, лиофилизуют. Удельная активность коллагеназы равна 11200 ед. на 1 мг белка. Липиды в препарате отсутствуют.

П р и м е р 2. 10 кг гепатопанкреаса краба-стригуна помещают в 30 л забуференного боратом раствора рН 7,8 и инкубируют при перемешивании в течение 8 ч при температуре 0^оС до полной гомогенизации гепатопанкреаса. К полученному раствору при интенсивном перемешивании добавляют раствор хитозана рН 2,0, доводя его конечную концентрацию до 0,4% Образовавшийся нерастворимый материал отделяют, а полученный раствор подвергают ультрафильтрации, отделяя сначала примесные вещества с мол.м. 100 КДа и выше, а затем примесные вещества с мол.м. 30 КДа и ниже. Раствор, содержащий ферментативную активность, лиофилизуют. Удельная активность коллагеназы равна 10800 ед. на 1 мг белка. Липиды в препарате отсутствуют.

П р и м е р 3. 10 кг гепатопанкреаса синего краба помещают в 30 л забуференного карбонатом раствора рН 8,3 и инкубируют при перемешивании в течение 3 ч при температуре 20^оС до полной гомогенизации гепатопанкреаса. К полученному раствору при интенсивном перемешивании добавляют раствор хитозана рН 6,5, доводя его конечную концентрацию до 0,01% Образовавшийся нерастворимый материал отделяют, а полученный раствор подвергают ультрафильтрации, отделяя сначала примесные вещества с мол.м. 100 кДа и выше, а затем примесные вещества с мол.м. 30 кДа и ниже. Раствор, содержащий ферментативную активность, лиофилизуют. Удельная активность коллагеназы равна 9800 ед. на 1 мг белка. Липиды в препарате отсутствуют. Таким образом, изобретение позволяет создать простой, легко масштабируемый и экологически чистый процесс выделения и очистки коллагеназы крабов при небольших затратах материалов, рабочего и технологического времени и сырья.

Использование: биотехнология, а именно препаративная биохимия, изобретение может быть использовано в меховой и кожевенной промышленности, в ветеринарии и медицине. Сущность изобретения: в качестве сырья для получения коллагеназы используют гепатопанкреас крабов. Выделение проводят при смешивании гомогената гепатопанкреаса крабов, полученного в результате автолитического гидролиза за счет эндопротеаз при температуре 0 30°С в течение 2 8 с, с раствором хитозана, pH 2,0 6,5, доводя его конечную концентрацию до 0,01 0,4 мас. а полученный раствор после отделения нерастворимого материала последовательно подвергают ультрафильтрации сначала на мембране, отсекающей примесные вещества с мол. м. 100 кДа и более, собирая проходящий через мембрану раствор, а затем на мембране, отсекающей вещества с мол. м. 30 кДа и ниже, собирая фермент, не проходящий через мембрану. Раствор, содержащий ферментативную активность, лиофилизуют. Удельная активность коллагеназы 10800 11200 ед/мг белка. Липиды в препарате отсутствуют.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОЛЛАГЕНАЗЫ, предусматривающий гомогенизацию гепатонкреаса промысловых крабов в забуференных водных растворах с последующей ультрафильтрацией, отличающийся тем, что, с целью повышения качества целевого продукта и упрощения процесса, гомогенизацию осуществляют путем автолиза, проводимого при перемешивании в течение 2 8 ч при температуре 0 - 30^oС, к полученному раствору при перемешивании добавляют раствор хитозана с pH 2,0 6,5 до достижения концентрации 0,01 0,4 мас. и отделяют нерастворимый материал, а ультрафильтрацию ведут последовательно на мембране, отсекающей примесные вещества с мол.м. 100 КДа и более, собирая проходящий через мембрану раствор, и затем на мембране, отсекающей вещества с мол. м. 30 КДа и менее, собирая фермент, не проходящий через мембрану.