СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОЛЛАГЕНАЗЫ ИЗ ГЕПАТОПАНКРЕАСА КРАБА-ОПИЛИО Российский патент 2025 года по МПК C11B1/00 A23L29/281 C12N9/64 

Изобретение относится к рыбной промышленности, а именно к способу получения жира и комплексов протеолитических ферментов из гидробионтов, в частности из краба-стригуна опилио.

Известен способ получения жира из печени кальмара, включающий измельчение печени кальмара, которое ведут без предварительного нагрева. Далее проводят обработку острым паром в течение 10 - 30 минут до температуры массы 80 - 95 °С и перемешивают в аппарате с рубашкой при этой температуре 60 - 120 минут. Затем полученный жир отделяют и рафинируют (Патент РФ №2241026, Кл. ⁷C11B 1/10, C11B 1/14, 2003 г.).

К недостаткам данного способа относят длительный нагрев жира, что ведет к потере части витаминов и полиненасыщенных жирных кислот омега-3.

Известен способ получения жира из отходов кальмара, в котором сырье измельчают до размера частиц 3 - 5 мм. Выделение жира ведут путем двухступенчатой спиртовой экстракции. При этом на первой ступени экстракцию осуществляют изопропиловым спиртом, при перемешивании и нагревании до температуры 60 - 80° С в течение 20 - 60 минут при соотношении изопропиловый спирт к сырью 2:1-10:1. А на второй ступени - этиловым спиртом при комнатной температуре и соотношении этиловый спирт: сырье 0,5:1 (Патент РФ №2266949, Кл. ⁷С11В 1/10, A23L 1/30, 2004 г.).

К недостаткам данного способа относят использование изопропилового и этилового спирта, что ведет к его остаточному содержанию в готовом продукте.

Известен способ получения жира из краба камчатского Paralithodes camtschaticus, включающий измельчение замороженного сырья и его термообработку. Термообработку проводят при температуре 45-75 °С в течение 20 - 50 мин. Полученную массу разделяют на жир-сырец и граксу, из которой дополнительно выделяют жир путем внесения изопропанола и нагрева до температуры 20 - 70 °С в течение 20 - 50 минут (Патент РФ №2390274, Кл. ⁷C11B 1/00, A23L 1/33, 2006 г.).

Известен способ получения комплекса протеолитических ферментов, включающий гомогенизацию гепатопанкреаса промыслового краба в водном растворе, затем гомогенат отстаивают и вводят сульфат аммония до насыщения 0,3. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием, а жидкую фазу фильтруют через слой ваты. После этого к полученному раствору добавляют сульфат аммония до насыщения 0,8, гомогенат отстаивают и центрифугируют. Осадок, содержащий комплекс ферментов, растворяют в дистиллированной воде, диализуют и лиофилизируют. (Авторское свидетельство СССР №546648, М. Кл. 2, 12D, 13/0, 1977 г.).

Наиболее близким аналогом является способ, предусматривающий смешивание гомогената гепатопанкреаса крабов, полученного в результате автолитического гидролиза за счет эндопротеаз при температуре 0-30°С в течение 2-8 с, с раствором хитозана, pH 2,0 6,5, доводя его конечную концентрацию до 0,01-0,4 мас., а полученный раствор после отделения нерастворимого материала последовательно подвергают ультрафильтрации сначала на мембране, отсекающей примесные вещества с мол. м. 100 кДа и более, собирая проходящий через мембрану раствор, а затем на мембране, отсекающей вещества с мол. м. 30 кДа и ниже, собирая фермент, не проходящий через мембрану (Патент РФ №2039819, М. Кл. 2, C12N 9/48, C12N 9/64, 1996 г.).

К недостаткам данного способа относят то, что при выделении ферментов из гепатопанкреаса промысловых крабов теряется жир, содержащий витамины и полиненасыщенные жирные омега кислоты.

Технической проблемой заявленного изобретения является усовершенствование способа получения коллагеназы с целью сохранения жира при получении комплекса протеолитических ферментов из гепатопанкреаса краба-стригуна опилио.

Техническим результатом изобретения является решение поставленной технической проблемы.

Заявленный технический результат достигается способом переработки краба-стригуна опилио, в котором:

- исходное сырье измельчают;

- осуществляют гомогенизацию гепатопанкреаса краба-стригуна опилио путём автолиза;

- после автолиза проводят термообработку при температуре от -30 °С до -18 °С в течение 2 - 16 часов;

- после термообработки осуществляют механическое отделение на жир-сырец и граксу, представляющую собой водную фазу;

- из водной жидкой фазы осаждают белок сульфатом аммония,

- осуществляют фильтрацию;

- отфильтрованный белок обессаливают и подвергают лиофильной сушке.

Сущность изобретения поясняется следующим образом.

Поставленная задача решается в способе получения коллагеназы, включающем измельчение замороженного гепатопанкреаса краба-стригуна опилио, автолиз, его термообработку, механическое отделение жира, осаждение белка сульфатом аммония, фильтрацию, микро и ультрафильтрацию, обессаливание и лиофильную сушку. Термообработку проводят при температуре от -30 °С до -18 °С в течение 2 - 16 часов для дальнейшего разделения на жир-сырец и граксу. Затем жир-сырец и граксу разделяют механически. Выделенный жир отстаивают, фильтруют и стабилизируют. Из полученного водного раствора сульфатом аммония осаждают белок. Полученный белок растворяют в минимальном количестве воды, подвергают микро и ультрафильтрации. Раствор, содержащий ферментативную активность, обессаливают и лиофилизуют. Полученная коллагеназа не содержит липидов и обладает высокой коллагеназной активностью.

Термообработка идёт при отрицательной температуре, так как при температуре выше 37 °С теряется ферментативная активность. При заморозке происходит разделение жировой и водной фракции. Жир остается сверху, а вода снизу замерзает. И далее механическим путем собирают жир.

Способ осуществляют следующим образом

В качестве исходного сырья используют замороженный до температуры минус 18°С гепатопанкреас краба-стригуна опилио Chionoecetes opilio. Замороженный гепатопанкреас краба измельчают до размера 5х5х5 см, полученную массу подают в реактор из пищевой нержавейки, снабженный мешалкой. Процесс ведут течение 6-15 часов при комнатной температуре, при этом добавляют очищенную воду 1:2, поваренную соль в количестве 3 - 5% и пищевую соду 1 - 2 % от массы гепатопанкреаса для интенсификации процесса автолиза и извлечения жира. Далее массу фильтруют на фильтрах 1-0,05 мм и осуществляют термообработку, помещая в холодильную камеру при температуре от -30 °С до -18 °С в течение 2 - 16 часов для разделения на жир-сырец и граксу. Затем жир-сырец и граксу разделяют механически. Выделенный жир отстаивают, фильтруют и стабилизируют. Полученную водную жидкую фазу фильтруют на бумажных фильтрах 5-12 мкм и добавляют твердый сульфат аммония до насыщения 0,8. Гомогенат отстаивают в течение 10 ч при температуре 4 °С, после чего декантируют осадок, который растворяют в минимальном количестве очищенной воды. Полученный раствор фильтруют на бумажных фильтрах 5-12 мкм, подвергают микрофильтрации на мембранах 0,1 мкм, а затем ультрафильтрации на мембранах 100 кДа, после чего обессаливают на мембранах 10 кДа. Раствор, содержащий ферментативную активность, стабилизируют и лиофилизуют.

Пример 1.

10 кг краба-стригуна опилио помещают в 30 л забуференного поваренной солью и пищевой содой раствора рН 8,0 и инкубируют в течение 15 часов при комнатной температуре до полной гомогенизации гепатопанкреаса. Далее массу последовательно фильтруют на фильтрах 1-0,05 мм и помещают в холодильную камеру при температуре при -30 °С в течение 2 часов для дальнейшего механического разделения на жир-сырец и граксу. Полученный раствор фильтруют на фильтрах 5 мкм и добавляют сульфат аммония до насыщения 0,8. Гомогенат отстаивают в течение 10 часов при температуре 4 °С, после чего декантируют осадок, который растворяют в 60 л очищенной воды. Полученный водный раствор фильтруют на бумажных фильтрах 5 мкм, затем подвергают микрофильтрации на мембранах 0,1 мкм, после чего ультрафильтрацией отделяют примесные вещества с мол.м. выше 100 кДа. Обессаливание проводят на мембранах 10 кДа. Раствор, содержащий ферментативную активность, стабилизируют сахарозой и лиофилизуют. Удельная активность коллагеназы равна 330 ед. на 1 мг белка клостридиальной коллагеназы (Collagenase Type I from Cl. histolyticum, Gibco, CAS № 9001-12-1), содержание белка в препарате 620 мкг/мг, выход целевого продукта 20 г.

Пример 2.

10 кг краба-стригуна опилио помещают в 30 л забуференного поваренной солью и пищевой содой раствора рН 8,0 и инкубируют в течение 15 часов при комнатной температуре до полной гомогенизации гепатопанкреаса. Далее массу последовательно фильтруют на фильтрах 1-0,05 мм и помещают в холодильную камеру при температуре при - 21 °С в течение 16 часов для дальнейшего механического разделения на жир-сырец и граксу. Полученный раствор фильтруют на фильтрах 5 мкм и добавляют сульфат аммония до насыщения 0,8. Гомогенат отстаивают в течение 10 часов при температуре 4 °С, после чего декантируют осадок, который растворяют в 60 л очищенной воды. Полученный водный раствор фильтруют на бумажных фильтрах 5 мкм, затем подвергают микрофильтрации на мембранах 0,1 мкм, после чего ультрафильтрацией отделяют примесные вещества с мол.м. выше 100 кДа. Обессаливание проводят на мембранах 10 кДа. Раствор, содержащий ферментативную активность, стабилизируют сахарозой и лиофилизуют. Удельная активность коллагеназы равна 428 ед. на 1 мг белка клостридиальной коллагеназы (Collagenase Type I from Cl. histolyticum, Gibco, CAS № 9001-12-1), содержание белка в препарате 875 мкг/мг, выход целевого продукта 23 г.

Пример 3.

10 кг краба-стригуна опилио помещают в 30 л забуференного поваренной солью и пищевой содой раствора рН 8,0 и инкубируют в течение 15 ч при комнатной температуре до полной гомогенизации гепатопанкреаса. Далее массу последовательно фильтруют на фильтрах 1-0,05 мм и помещают в холодильную камеру при температуре при - 18 °С в течение 8 часов для дальнейшего механического разделения на жир-сырец и граксу. Полученный раствор фильтруют на фильтрах 5 мкм и добавляют сульфат аммония до насыщения 0,8. Гомогенат отстаивают в течение 10 ч при температуре 4 °С, после чего декантируют осадок, который растворяют в 60 л очищенной воды. Полученный водный раствор фильтруют на бумажных фильтрах 5 мкм, затем подвергают микрофильтрации на мембранах 0,1 мкм, после чего ультрафильтрацией отделяют примесные вещества с мол.м. выше 100 кДа. Обессаливание проводят на мембранах 10 кДа. Раствор, содержащий ферментативную активность, стабилизируют сахарозой и лиофилизуют. Удельная активность коллагеназы равна 372 ед. на 1 мг белка клостридиальной коллагеназы (Collagenase Type I from Cl. histolyticum, Gibco, CAS № 9001-12-1), содержание белка в препарате 730 мкг/мг, выход целевого продукта 21 г.

Заявленное изобретение позволит расширить ассортимент продукции, получаемой из крабов.

Изобретение относится к рыбной промышленности. Способ переработки краба-стригуна опилио, характеризующийся тем, что в качестве исходного сырья используют замороженный гепатопанкреас краба-стригуна опилио, которое измельчают, затем осуществляют гомогенизацию гепатопанкреаса краба-стригуна опилио путём автолиза, после автолиза проводят термообработку при температуре от -30 °С до -18 °С в течение 2-16 часов, после термообработки осуществляют механическое отделение на жир-сырец и граксу, представляющую собой водную фазу, из водной жидкой фазы осаждают белок сульфатом аммония, далее осуществляют фильтрацию, отфильтрованный белок обессаливают и подвергают лиофильной сушке. Изобретение позволяет усовершенствовать способ получения коллагеназы с целью сохранения жира при получении комплекса протеолитических ферментов из гепатопанкреаса краба-стригуна опилио. 1 з.п. ф-лы, 3 пр.

1. Способ переработки краба-стригуна опилио, в котором:

- в качестве исходного сырья используют замороженный гепатопанкреас краба-стригуна опилио;

- исходное сырье измельчают;

- осуществляют гомогенизацию исходного сырья путём автолиза;

- после автолиза проводят термообработку при температуре от -30 °С до -18 °С в течение 2-16 часов;

- после термообработки осуществляют механическое отделение на жир-сырец и граксу, представляющую собой водную фазу;

- из водной жидкой фазы осаждают белок сульфатом аммония;

- осуществляют фильтрацию;

- отфильтрованный белок обессаливают и подвергают лиофильной сушке.

2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что используют гепатопанкреас краба-стригуна опилио, замороженный до температуры -18 °С.