СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МИЕЛОПИДА Российский патент 2004 года по МПК A61K35/28 

Изобретение относится к технологии получения иммуномодулирующего препарата из костного мозга животных.

Известен способ получения Миелопида, включающий приготовление суспензии клеток костного мозга в окрашенной 199 среде, их инкубирование в той же среде, отделение супернатанта и выделение из него целевого продукта путем последовательного проведения ультрафильтрации, лиофильной сушки, растворения в стерильной воде, стерильной фильтрации и гель-хроматографического разделения на сефадексе G-25 с использованием фосфатного буфера (RU 2041716 С1, 20.08.1995).

Недостатками этого способа являются высокая трудоемкость и сложность технологии, связанные с необходимостью очистки целевого продукта от используемого при суспендировании и инкубировании клеток красителя фенолового красного, входящего в состав 199 среды, и низкий выход целевого продукта, составляющий 250-300 доз из 1·10¹⁰ клеток.

Техническим результатом изобретения является сокращение трудозатрат, упрощение технологии и увеличение выхода целевого продукта.

Этот результат достигается тем, что в способе получения Миелопида, включающем приготовление суспензии клеток костного мозга, их инкубирование в питательной среде, отделение супернатанта и последующее выделение из него целевого продукта, согласно изобретению для суспендирования и инкубирования клеток используют неокрашенную среду, а выделение целевого продукта осуществляют путем пропускания супернатанта через биоспецифический сорбент Адан и экстрагирования адсорбированного материала водным раствором этилового спирта в уксусной кислоте.

Предпочтительным вариантом воплощения настоящего изобретения предусмотрено использование для суспендирования и инкубирования среды, содержащей следующие компоненты, мг/дм³:

CaCl₂ 200

Fe(NO₃)₂·9H₂O 0,1

KCl 400

MgSO₄·7Н₂O 200

NaCl 6800

NaHCO₃ 2200

NaH₂PO₄·H₂O 140

Аденин 10

Натриевая соль аденинтрифосфата 10

Адениновая кислота 0,2

Холестерол 0,2

2-деоксирибоза 0,5

Глюкоза 1000

Глутатион 0,05

Гуанин хлорид 0,3

Гипоксантин 0,3

Рибоза 0,5

Ацетат натрия 50

Тимин 0,3

Твин 80 20

Урацил 0,3

Ксантин 0,3

DL-аланин 50

L-аргинин хлорид 70

DL-аспарагиновая кислота 50

L-цистеин хлорид 0,1

L-цистидин 20

L-глутамин 100

DL-глутаминовая кислота·H₂O 150

Глицин 50

L-гистидин хлорид 20

L-гидроксипролин 10

DL-изолейцин 40

DL-лейцин 120

L-лизин хлорид 70

DL-фенилаланин 50

DL-метионин 50

L-пролин 40

DL-серин 50

DL-треонин 60

DL-триптофан 20

L-тирозин 40

DL-валин 50

р-аминобензойная кислота 0,05

Аскорбиновая кислота 0,05

Биотин 0,01

Кальциферол 0,1

Холин хлорид 0,5

Фолиевая кислота 0,01

i-инозитол 0,05

Менадион 0,01

Никотинамид 0,025

Никотиновая кислота 0,025

Натриевая соль пантотеновой кислоты 0,01

Пиридоксал хлорид 0,025

Пиридоксин хлорид 0,025

Рибофлавин 0,01

Тиамин хлорид 0,01

п-токоферолфосфат натрия 0,01

Витамин А 0,1

Другим предпочтительным вариантом предусмотрено использование 50-80% раствора этилового спирта в 0,1% водном растворе уксусной кислоты.

Способ реализуется следующим образом.

Клетки костного мозга извлекают из измельченных костей животных путем суспендирования в жидкой неокрашенной среде с последующей фильтрацией, центрифугированием и разбавлением неокрашенной питательной средой, содержащей смесь витаминов, аминокислот и компонентов нуклеиновых кислот в солевом растворе Хенкса, предпочтительно в указанном выше соотношении компонентов. Затем осуществляют инкубирование клеток при традиционных параметрах процесса и отделяют супернатант центрифугированием. Из супернатанта выделяют целевой продукт путем его адсорбции на биоспецифическом сорбенте Адан (ТУ 6-02-98-94) с последующим экстрагированием водным раствором этилового спирта в уксусной кислоте, предпочтительно с концентрацией этилового спирта 50-80% по объему в 0,1% по объему водном растворе уксусной кислоты. Использование названного состава экстрагента позволяет минимизировать его расход, последующие трудо- и энергозатраты на выделение целевого продукта и потери его активных компонентов, что увеличивает выход целевого продукта.

Пример 1.

8 кг зачищенных реберных костей свиней измельчают в стерильных условиях. К ним добавляют 3 л стерильной жидкой питательной среды описанного выше состава. Суспензию встряхивают на шейкере при 37°С в течение 1 часа для вымывания клеток костного мозга. Клетки отделяют фильтрацией и отмывают центрифугированием в той же питательной среде при 4°С. Полученные клетки разбавляют той же средой, доводя их концентрацию до 1·10⁹ клеток/дм³, и инкубируют в течение 18-20 часов при 37°С. Далее отделяют супернатант центрифугированием при 5000 об/мин и температуре 4°С. Супернатант пропускают через колонку, заполненную биоспецифическим сорбентом Адан. Адсорбированный материал экстрагируют при 6°С, используя в качестве экстрагента 50-80% раствор этилового спирта в 0,1% водном растворе уксусной кислоты. При концентрации выше указанной экстракция не происходит. При концентрации ниже указанной резко увеличивается расход экстрагента, что при последующей лиофильной сушке препарата приводит к увеличению времени сушки и энергетических затрат, а также к снижению активности препарата. Выход продукта с коэффициентом стимуляции 1,8 колеблется от около 40000 доз препарата при граничных значениях концентрации экстрагента до 50000 при концентрации этилового спирта в экстрагенте 60% по объему.

Биологический эффект целевого продукта оценивают по стимуляции антителообразования на пике вторичного иммунного ответа к эритроцитам барана (Jerne N.K., Nordin A.A.// Science, 1983, v. 140, р. 405), добавляя тестируемый материал в культуру клеток лимфатических узлов, полученных от мышей на четвертые сутки после повторной иммунизации. Коэффициент стимуляции рассчитывают как отношение количества антителообразующих клеток (АОК) в культуре с тестируемым образцом к количеству АОК в контроле. Результаты испытаний приведены в таблице.

Таким образом, при упрощенной технологии и сниженных трудозатратах предлагаемый способ позволяет увеличить выход Миелопида.

Пример 2.

Препарат готовят по примеру 1, но с использованием питательной среды, содержащей следующие компоненты, мг/дм³:

CaCl₂ 200

Fе(NО₃)₃·9Н₂O 0,1

KCl 400

MgSO₄·7H₂O 200

NaCl 5400

NаНСО₃ 3700

NaH₂PO₄·H₂O 124

Глюкоза 4600

Пируват натрия 110

Гептамицин 15

L-аргинин хлорид 84

L-цистидин 48

L-глутамин 780

Глицин 30

L-гистидин хлорид водный 42

L-изолейцин 105

L-лейцин 105

L-лизин хлорид 146

L-метионин 30

L-фенилаланин 86

L-серин 42

L-треонин 85

L-триптофан 18

L-тирозин 72

L-валин 94

Холин хлорид 4

Фолиевая кислота 4

i-инозитол 7,2

Никотинамид 4

Натриевая соль пантотеновой кислоты 4

Пиридоксал хлорид 4

Рибофлавин 0,4

Тиамин хлорид 4

Выход продукта с коэффициентом стимуляции 1,8 колеблется от 20000 до 32000 доз препарата при различной концентрации этилового спирта в экстрагенте.

Пример 3.

Препарат готовят по примеру 1, но с использованием питательной среды, содержащей следующие компоненты, мг/дм³:

Са(NО₃)₂·4Н₂O 100

KCl 400

МgSO₄·7Н₂O 100

NaCl 6000

NaHCO₃ 2000

Na₂HPO₄ 801

Глюкоза 2000

Глутатион 1

Гептамицин 15

L-аргинин хлорид 342

L-аспарагин 50

L-аспарагиновая кислота 20

L-цистидин 50

L-глутамин 500

L-глутаминовая кислота 20

Глицин 10

L-гистидин хлорид 18,2

L-гидроксипролин 20

L-изолейцин 50

L-лейцин 50

L-лизин хлорид 50

L-метионин 15

L-фенилаланин 15

L-пролин 20

L-серин 30

L-треонин 25

L-триптофан 5

L-тирозин 20

L-валин 20

р-аминобензойная кислота 1

Биотин 0,2

Холин хлорид 3

фолиевая кислота 1

i-инозитол 36

Никотинамид 1

Натриевая соль пантотеновой кислоты 0,75

Пиридоксал хлорид 1

Рибофлавин 0,2

Тиамин хлорид 1

Витамин B₁₂ 0,008

Выход продукта с коэффициентом стимуляции 1,8 колеблется от 12000 до 25000 доз препарата при различной концентрации этилового спирта в экстрагенте.

Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения биологически активных препаратов из костного мозга животных. Способ включает приготовление суспензии клеток костного мозга, их инкубирование в питательной среде, отделение супернатанта и последующее выделение из него целевого продукта, при этом для суспендирования и инкубирования клеток используют неокрашенную среду, а выделение целевого продукта осуществляют путем пропускания супернатанта через биоспецифический сорбент Адан и экстрагирования адсорбированного материала 50-80% раствором этилового спирта в 0,1% водном растворе уксусной кислоты. Приведен состав предпочтительного варианта питательной среды. Способ позволяет увеличить выход целевого продукта при упрощении технологии производства и сокращении трудозатрат. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения Миелопида, включающий приготовление суспензии клеток костного мозга, их инкубирование в питательной среде, отделение супернатанта и последующее выделение из него целевого продукта, отличающийся тем, что для суспендирования и инкубирования клеток используют неокрашенную среду, а выделение целевого продукта осуществляют путем пропускания супернатанта через биоспецифический сорбент Адан и экстрагирования адсорбированного материала 50-80%-ным раствором этилового спирта в 0,1%-ном водном растворе уксусной кислоты.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для суспендирования и инкубирования клеток костного мозга используют среду, содержащую следующие компоненты, мг/дм³:

СаСl₂ 200

Fe(NO₃)₂·9H₂O 0,1

КСl 400

MgSO₄·7H₂O 200

NaCl 6800

NaHCO₃ 2200

NaH₂PO₄·H₂O 140

Аденин 10

Натриевая соль аденинтрифосфата 10

Адениновая кислота 0,2

Холестерол 0,2

2-Деоксирибоза 0,5

Глюкоза 1000

Глутатион 0,05

Гуанин хлорид 0,3

Гипоксантин 0,3

Рибоза 0,5

Ацетат натрия 50

Тимин 0,3

Твин 80 20

Урацил 0,3

Ксантин 0,3

DL-аланин 50

L-аргинин хлорид 70

DL-аспарагиновая кислота 50

L-цистеин хлорид 0,1

L-цистидин 20

L-глутамин 100

DL-глутаминовая кислота·Н₂О 150

Глицин 50

L-гистидин хлорид 20

L-гидроксипролин 10

DL-изолейцин 40

DL-лейцин 120

L-лизин хлорид 70

DL-фенилаланин 50

DL-метионин 50

L-пролин 40

DL-серин 50

DL-треонин 60

DL-триптофан 20

L-тирозин 40

DL-валин 50

р-Аминобензойная кислота 0,05

Аскорбиновая кислота 0,05

Биотин 0,01

Кальциферол 0,1

Холин хлорид 0,5

Фолиевая кислота 0,01

i-Инозитол 0,05

Менадион 0,01

Никотинамид 0,025

Никотиновая кислота 0,025

Натриевая соль пантотеновой кислоты 0,01

Пиридоксаль хлорид 0,025

Пиридоксин хлорид 0,025

Рибофлавин 0,01

Тиамин хлорид 0,01

п-Токоферолфосфат натрия 0,01

Витамин А 0,1