Способ получения стимулятора антителопродуцентов Советский патент 1983 года по МПК A61K39/00 

сд

со 110 Изобретение относится к медицине в частности к иммунологии, и может быть использовано при получении костномозгового стимулятора антителопродуцентов (САП). Известен способ получения стимулятора антителопродуцентов путем выделения клеток из костного мозга мышей с по-; следующими инкубированием их в питатель ной среде, концентрированием и элюцией надосадочной жидкости l3Однако известный способ является трудоемким, так как выделение клеток костного мозга и Получение препарата САП осуществляют из трубчатых костей 80-ти мыщей при помощи шприца, в результате чего повышается гибель клеток костного мозга и уменьшается выход целевого продукта (1О мг из 2-10 клеток), а кроме того для получения САП проводят диа- ЛИЗ, который повышает вымывание части белков, в том числе и САП. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта и упрощение способа. Ук 1занная цель достигается тем, что согласно спосжбу получения стимулятора антителопродуцентов путем выделения клеток ис.1 костного мозга животных инкубируют их в питательной среде, концент- д рЧруют и элюируют Надосадочную жидкость, клетки выделяют -из костноГо мозга свиньи, для инкубирования используют клетки в концентрации 310 на 1 мл. питательной среды и инкубирование про- . водят в течение 10-24 ч, а элюцто осущест вляют нейтральной дистиллированной водой, :|; Пример. САП выделяют из клеток костного мозга свиньи. При разделы902ванни туши сгвиньи-на мясокомбинате извлекают ребра. Изъятие ребер проводят после нутровки специальным приспособлением, состояШим из широкой длинной ручки и металлического ножа, заточенного с двух сторон. Клетки костного мозга извлекают из ребер путем отжима на прессе с помощью специальной формы. После отжима и смыва питательной средрй клетки костного мозга под вакуумом отсасывают из формы в стерильные фпа- коны.-Клетки .в концентрации 3 10 кл/мл инкубируют в среде 199 с- добавлением хепес-буфера (1 М), глютамина (2 ОО мМ) . и пенициллина (ЮОед) в течение 18 ч при в культуральных флаконах по 1ОО-15О мл суспензии на флакон, объем которого 1л. Надосадочную жидкос1ъ отдел5цот от клеток центрифугированием. концентрируют в целлофановых мешочках под вентилятором в ГО раз и наносят на колонку (ЗхЮО см) с сефадексом Q-50, уравновешенную нейтральной дистиллированной водой. Фракции, элюированные в области выхода цигохрома с молекулярной массой 1300О дальтон.,1 высушивают лио- филизацией, определяют в них.количество белка по реакции Лоури и либо используют в эксперименте, либо хранят при , Выход САП составляет 80-100 мг из 1-Ю ядросодержащих клеток, выделенных из одного рёбра. Использование клеток в концентрации 310° или З-ю и инкубирование их в течение 10 или 24 ч приводит к аналогичному выходу препарата. Однако оптимальной концентрацией клеток является 3-ЮЪсл/мл (табл. 1 и 2). Таблица 1

Таблица 2

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТИМУЛЯТОРА АНТИТЕЛОПРОДУЦЕНТОВ путем выделения клеток на костного мозга животных с последующим нв1 би роввввем их в питательной среде, концентрированием и элюцией 1 вадосаДочной жидкости, отличающийся тем, что, с пелью повышения выхода целевого продукта и упрощения способа, клетки уялаепяют из костного мозга свиньи, для инкубирования используют клетки в концентрации « 3 .10 на 1 мл питательной среды и инкубирование проводят в течение 1О-24 ч, а элюцию осуществляют нейтральной дистиллированной водой. (Л с

3 10

3291118 О,7

4 413i58 423t653 г 10Ь

.319190 282±47

3 10

3 Ю

4 382182 150±22.2,5

3 io®.

158tl5 12Qil5

Оценку активности САП проводят в культуре ИИ витро и в системе ин виво по тесту стимуляции, ант телообразования. Для определения активности САП в культуре ин .витро исследуемый препарат в дозе 50-7О мкг и в объеме ОД Мл добавляют в куда туру клеток ли мфатически х узлов, содержащихся в 1 мп питательной среде в концентрации Г- 10 клеток. Лимфатические узлы получают от мышей на четвертые сутки-вторичного иммунного ответа к эритроцитам барана. Через 20 ч культивирования определяют число анти- 35

телообразующих клеток (АОК) по реакции Ерне и сравнивают его с числом АОК в контрольных культурах. .

.Оценку активности САП в системе ин « иво проводят при локальном введении, репарата мышам на четвертые сутки вторичйого иммунного ответа к эритроцитам барана. САП в дозе 10О мкг, со держащихся в 0,1 мл питательной среды,.45 вводят в подушечку задней конечности мыши. В другую конечность, служившую контролем, вводят Питательную среду. На следующий день у этих мышей извлекают клетки подколенных лимфатических узлов 50 и определяют в них число АОК, cpaBHioвая их количество в опыте н контроле.

1,0

1,2

0р5

1,5

iO,O5

. Коэффициент стимуляции антителообразования К в обеих моделях рассчитывают как отношение количества АОК, приходящихся на ядросодержаших клеток в опыте, к соответствуюшеК1у количестеу АОК в контроле.

САП, полученный данным способом, сохраняет- -все свои биологические и - зико-химические свойства. Он имеет молекулярную массу около 13ООО дальтон, в его входят рибонуклеиновая и белковая компоненты. Введение его животным на . пике иммунного ответа приводит- к аналогичному увеличению количества антителопродуцентов, как и в известном (табп.З). Лиофилизацня препарата, используемая при предлагаемом способе получения, увеличивает срок его храненегя до двух лет. При ранее известн)м способе срок хранения САП составлял 3 мес.

Зависимости величины эффе.кта стимуляции антителообразования от концентрации клеток костного мозга свиньи н мы um приведены в табл. 1 н 2 соответственно. Сравнительная характеристика биологической активности костномоэгового стимулятора антителопродуцентов (САП), полученного от различных вндов яшвог. ных, и активность САП при разных спо-. собах его хранения приведены в табл. 3. Клетка костного мозга эмбриона крупного рогатого 30 скота САП, йыделенный из клеток костного 8О мозга свиньи САП свиньи пиофили зованный после пер45вого года Хранения САП, выдед-енный из клеток костного моз65га мыши САП мыши после трех месяцев хра36нения и растворе

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать значительно большее количество целевого продукта. Из одного ребра свиньи можно выделить тшсое .же копИчество клеток, сколько из бедренных костей 80 шт. мышей ( кле- 35 yoK)s что значительно удешевляет получе ние САП

Т а б л и,ц а 3

.: -.- . . - -

0,О5

О,О5

0,005

0,005

0,1

При выдавливании клеток из ребер свиней при помоши пресса затрачивается в 20 раз меньше времени, чем при вымывании их из бедрюнных костей мышей шприцом. Данная процедура позволяет повысить жизнеспособность культивируемых клеток костного мозга и повысить выход целевого продукта (САП) до 100 мг. 448±49 28О±46 1,6 358t87 153143 2,3 450178 222±35 2,О 44Oi39 163118 2,7 8334236 О,9