ГЕКСАПЕПТИД(БИВАЛФОР), ОБЛАДАЮЩИЙ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 1996 года по МПК C07K7/06 

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для создания препарата, применяемого в противоопухолевой терапии.

Известно, что опухолевые клетки независимо от их природы выделяют вещества, угнетающие или нарушающие нормальное функционирование имунной системы [1] Показано, например, что характерная для острых миелоидных лейкозов (ОМЛ) дисфункция Т-лимфоцитов связана с супрессивным действием на них продуктов лейкозных клеток [2] Введение в организм известных медиаторов иммунной системы (интерферонов, интерлейкинов, колониестимулирующих факторов), являющихся естественными продуктами иммунокомпетентных клеток, оказывает в ряде случаев выраженный противоопухолевый эффект [3] Указанные цитокины являются полипептидами с молекулярной массой 15 70 кДа. Их получают биотехнологическим, генно-инженерным способом. Введение в организм больного этих сравнительно крупных молекул (обычно используют интерлейкин-2) в лечебных дозах вызывает, как правило, тяжелые побочные эффекты [4] Поскольку терапевтическое, противоопухолевое действие большинства цитокинов основано на восполнении их активности в организме опухоленосителей, положительный эффект от их использования носит кратковременный, обратимый характер и для его поддержания требуется многократное введение препарата, что повышает вероятность неблагоприятного, порой летального исхода. Необходимо еще учесть, что время полужизни большинства цитокинов в организме составляет минуты и для достижения лечебного эффекта также требуется увеличение вводимых доз препарата, особенно, если необходим повторный курс лечения (для большинства онкологических больных этот курс, как правило, необходим).

Ближайшим аналогом по строению к заявленному соединению является гексапептид формулы I (Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp), оказывающий модулирующее влияние на болевую чувствительность [5] Противоопухолевая его активность не известна.

Цель изобретения новое низкомолекулярное соединение, обладающее противоопухолевой активностью.

Поставленная цель достигается новым гексапептидом формулы II (OHC-Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp), отменяющим токсический эффект опухолевых клеток на функциональную активность Т-лимфоцитов.

Заявляемое соединение предлагается назвать бивалфором.

По сравнению с известным медиатором иммунитета интерлейкином-2, обладающим подобным эффектом [2] заявленный гексапептид имеет низкий молекулярный вес (927 Да). Он способен стимулировать продукцию эндогенных медиаторов (интерлейкина-2) Т-лимфоцитами. Наличие на N-конце пептида формильной группы повышает его устойчивость к действию аминопептидаз, что может обеспечить пролонгированный эффект. Все эти свойства дают возможность вводить его в малых дозах по сравнению с интерлейкином-2 и избежать нежелательных тяжелых побочных эффектов, сопровождающих лечение интерлейкином-2. Кроме того, синтетический способ изготовления гексапептида значительно дешевле генно-инженерного способа получения рекомбинантного интерлейкина-2, используемого в клинике.

Описываемый гексапептид, получают твердофазным методом, наращивая пептидную цепь по N-концу. Формилирование пептида после его снятия со смолы и деблокирования осуществляли муравьиной кислотой. Полученный пептид очищали обращенно-фазовой хроматографией.

Пример 1. Синтез бивалфора OHC-Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp.

Синтез пептида проводили на автоматическом синтезаторе пептидов Biosearch 9600 (США) на РАС-смоле, используя Fmoc/DIPCDI-метод по стандартной программе c FID, прилагаемой к прибору. Конденсацию Fmoc-аминокислот проводили карбодиимидным методом, для подавления рацемизации добавляли эквимолярные количества 1-оксибенэтриазола. Остаток тирозина вводили в виде его о-трет-бутилового эфира. Стартовую аминокислоту триптофан присоединяли к 10 г РАС-полимера в количестве 0,155 г (0,76 ммоль) аминокислоты на 1 г полимера. Далее Trp-полимер обрабатывали 0,4 М растворами соответствующих защищенных аминокислот, содержащими примерно 7-кратный избыток защищенной аминокислоты с диизопропилкарбодиимида. Отщепление Fmoc-группы после конденсации проводили смесью пиперидин толуол диметилформамида (30 35 35). После окончания синтеза пептид отщепляли от смолы трифторуксусной кислотой, содержащей 2,5 этандиола и 2,5 воды при охлаждении льдом в течение 1,5 ч. Полученный пептид выделяли и очищали высокоэффективной хроматографией на колонке Диасорб-130 С-16 Т, 10 мкм, размером (26 х 250 мм) в градиенте ацетонитрила в 0,05 М фосфатном буфере рН 3,0 и обессоливали на той же колонке. После лиофилизации получали 0,2 г (30) белого аморфного порошка, гомогенного по данным ВЭЖХ. Аналитическую хроматографию проводили на колонке Ультрасфера ODS-3 в градиенте ацетонитрила (20 80) в 0,05 М фосфатном буфере рН 3,0, детекцию осуществляли при 220 нм. Аминокислотный анализ кислого гидролизата (6 N HCl, 20 ч) показал наличие следующих аминокислот: Leu 1 (0,95) Val 2 (1,87), Tyr 1 (1,03), Pro 1 (0,96).

Далее 1 мг полученного пептида растворяли в 0,5 мл 98 муравьиной кислоты, добавляли 0,25 мл уксусного ангидрида и выдерживали 30 мин при 18^oC. Раствор упаривали при комнатной температуре и очищали высокоэффективной хроматографией на колонке Ультрасфера С-18 ODS (4,6 х 250) в градиенте ацетонитрила (5 60) в 0,1 трифторуксусной кислоте. Получали 0,5 мг (47) формилированного пептида.

Пример 2. Способность синтетического гексапептида бивалфора восстанавливать активность Т-лимфоцитов, угнетенную опухолевыми клетками человека.

Известно, что опухолевые клетки больных ОМЛ, а также клетки линии HL-60, ведущей происхождение от лейкозных клеток костного мозга этих больных, продуцирующих белки, угнетающие функции Т-лимфоцитов, что выражается в резком снижении их способности отвечать пролиферацией на воздействие митогена (фитогемагглютинина, ФГА) [2]
Свежевыделенные Т-лимфоциты периферической крови здоровых доноров в концентрации 1•10⁶ клеток/мл стимулировали к пролиферации ФГА (3 мкг/мл). В конце 3 суток инкубации Т-лимфоцитов с митогеном в инкубационную смесь вводили ³Н-тимидин (2 мкКи/ммоль), по включению которого в ДНК Т-лимфоцитов судили об их пролиферативной активности, и выдерживали 4 ч. Если в данную инкубационную смесь в начале инкубирования добавить 10 кондиционной среды (КС) от лейкозных клеток HL-60, то уровень пролиферации Т-лимфоцитов в ответ на ФГА снижается в среднем на 50 по сравнению с контролем (100 инкубация без КС HL-60 (табл. 1). Как показано в работе [2] такая супрессия Т-лимфоцитов человека, вызванная действием на них продуктов лейкозных клеток, сопровождается резким спадом продукции Т-лимфоцитами интерлейкина-2 и возможно других лимфокинов.

Установлено, что предлагаемый гексапептид бивалфор способен восстанавливать редуцированный ФГА-ответ Т-лимфоцитов до нормального уровня (табл. 1).

Важно отметить, что способность бивалфора восстанавливать пролиферативный ответ Т-лимфоцитов обнаруживала четкую дозовую зависимость в интервале концентраций от 1 до 100 мкг/мл. Дозы пептида, меньшие 1 мкг/мл, не обладали этой способностью.

Пример 3. Способность синтетического гексапептида бивалфора усиливать продукцию интерлейкина-2.

С целью выявления влияния бивалфора на продукцию интерлейкина-2 была использована модель продукции IL-2 клетками селезенки мыши, активированными конкановалином А (Кон К). К свежевыделенным клеткам селезенки мышей (СВАхС57BL)F₁ в концентрации 5•10⁶ клеток/мл добавляли Кон А (5 мкг/мл) и исследуемый пептид в концентрации 0,001 мкг/мл. Клетки инкубировали при 37^oC во влажной атмосфере, содержащей 5 СО₂, в течение 36 ч. После этого в надосадочной жидкости определяли содержащие IL-2 по способности поддерживать пролиферативную активность IL-2-зависимой клеточной линии цитотоксических Т-лимфоцитов CTLL-2. Для этого в лунки 96-луночного пластикового планшета помещали суспензию клеток CTLL-2 (1•10⁴ клеток в 100 мкл) и триплетами добавляли тестируемый материал так, чтобы в конечном объеме 200 мкл его объемные концентрации составляли 1/2, 1/4, 1/8, 1/32, 1/64 и 1/128. В контрольные лунки добавляли супернатант Кон А стимулированных спленоцитов, культивированных без пептидов.

Пролиферативный ответ клеток оценивали колориметрическим методом по степени восстановления краски МТТ до формазона [6] Для этого за 4 ч до окончания культивирования в каждую лунку добавляли 20 мкл краски МТТ с концентрацией 5 мг/мл. По окончании инкубации планшеты центрифугировали, надосадочную жидкость удаляли из лунок, осадок растворяли в 100 мкл диметилсульфоксида при непрерывном встряхивании в течение 15 мин. Оптическую плотность содержимого лунок измеряли на приборе Multiscan при длине волны 540 нм. По полученным данным строили кривые зависимости оптической плотности от log₂ серии разведений исследуемых супернатантов с использованием пакета программ обработки экспериментальных данных Statgraf и определяли степень разведения супернатанта, обеспечивающую 50 -ный пролиферативный ответ. Данная величина считалась показателем количества IL-2, присутствующего в супернатанте. В таблице 2 приведены величины IL-2 продукции Кон А стимулированными спленоцитами мыши при добавлении бивалфора по сравнению с его продукцией в контроле без добавления пептида.

Из данных таблицы 2 следует, что синтетический пептид бивалфор усиливает продукцию IL-2 стимулированными Кон А спленоцитами в 1,5 раза.

Таким образом, гексапептид бивалфор обладает способностью отменять ингибирующее действие продуктов лейкозных клеток HL-60 на пролиферативный ответ Т-лимфоцитов человека, что может быть связано с его стимулирующим эффектом на продукцию IL-2 Т-лимфоцитами.

Пример 4. Изучение токсичности гексапептида бивалфор.

Бивалфор вводили подопытным мышам (СВАхС57BL)F₁ внутрибрюшинно в терапевтических дозах (исходя из эффективных доз используемых в клинике тимусных пептидов) и в дозах, в 30 раз превышающих таковые (0,5 4 мг/кг и 120 мг/кг соответственно). Введение были одно-, двух- и пятикратные с интервалами 0,96 и 24 ч. Выживаемость животных оценивали на 10-й день после окончания курса введения бивалфора. Результаты опыта представлены в таблице 3.

Из данных таблицы следует, что синтетический пептид бивалфор, введенный животным в терапевтических зонах, а также в дозе, в 30 раз превышающей терапевтическую, практически не вызывает их гибели.

Использование: в медицине, а именно в онкологии, для создания препарата, применяемого в противоопухолевой терапии. Сущность изобретения: продукт, гексапептид формулы OHC-Leu-Va1-Va1-Tyr-Pro-Trp, C₄₂H₅₇N₇O₉. Указанный гексапептид отменяет токсический эффект опухолевых клеток на функциональную активность Т-лимфоцитов, стимулирует продукцию эндогенных медиаторов /интерлейкина-2/ Т-лимфоцитами, нетоксичен. Гексапептид получают твердофазным методом, наращивая пептидную цепь по N-концу. Формилирование пептида после его снятия со смолы и деблокирования осуществляют муравьиной кислотой. Полученный пептид очищают обращенно-фазовой хроматографией. 3 табл.

Гексапептид формулы OHC-Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp, обладающий противоопухолевой активностью.