СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРА КЛЕТОЧНОЙ ПРОЛИФЕРАЦИИ Российский патент 1996 года по МПК A61K35/26 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения ингибиторов клеточной пролиферации.

В настоящее время в качестве клеточной пролиферации наибольшее применение получили цитостатики [1]
Недостатком препаратов является наличие многочисленных побочных эффектов, связанных с нарушением иммунного статуса.

Известно получение ингибитора клеточной пролиферации путем обезвоживания и обезжиривания лимфоцидных тканей млекопитающих с последующей экстракцией водой и лиофилизацией. Препарат угнетает лейкозные клетки, при этом оказывает слабое стимулирующее действие на нормальные [2]
Прототипом заявляемого изобретения является усовершенствованный метод получения препаратов из лимфоидных тканей (селезенки), заключающийся в том, что перед извлечением селезенки в организм водят циклофосфат или иные препараты, разрушающие ткань [3]
Недостатками прототипа являются невозможность получения высокоселективного препарата, нетехнологичность процесса получения.

Проблема получения более эффективного препарата за счет более технологического способа решается путем, предложенным авторами.

Способ включает в себя гомогенизацию измельченных тканей, экстракцию их водой при 4-10^o в течение 16-20 часов с последующим отделением нерастворимых частиц фильтрованием, после чего продукт подвергают ультрафильтрации на мембранах со средним размером пор , смешивают со стабилизатором конечной концентрации последнего в соотношении 0,05-1% и лиофилизуют, а затем готовят лекарственную форму. В качестве стабилизатора используют полиглюкин, реополиглюкин или желатиноль, которые обеспечивают образование защитного комплекса с активными центрами. В качестве лимфоидных тканей используют селезенку свиней, кролика.

Для получения лекарственной формы лиофилизат растворяют в воде, исходя из требуемой удельной активности, выдерживают не менее двух часов для созревания, затем стерилизуют и фасуют.

Отличиями заявляемого способа от прототипа являются: использование для очистки продукта ультрафильтрации на мембранах, введение соединений, стабилизирующих активные центры препаратов, а также введение новой технологии получения готовой лекарственной формы, включающей созревание препарата, и выдерживание его при пониженной температуре не менее двух часов.

Ранее в литературе данная совокупность операций не описана. В литературе известно применение в качестве источников сырья лимфоидных тканей с последующей экстракцией, отделением водной части центрифугированием, осаждением целевого продукта этанолом, растворением в воде и гельхроматографией на сефадексе G-75 [4] (а. с. 1506669, недоступное неограниченному кругу лиц, что исключает его выбор в качестве прототипа). Однако эта технология не позволяет получить конечный продукт высокой активности, а также непригодна для использования в производстве, кроме того получаемый препарат пирогенен.

Значительные отличия заявляемого способа от аналога, получение высокоактивного препарата, не достижимого при известных методах переработки, подтверждают соответствие изобретения критерию "изобретательский уровень".

Сущность изобретения и возможность практического использования иллюстрируются примерами.

Пример 1. 1,0 кг лимфоузлов свиньи помещали в гомогенизатор при 4000 об/мин на 4 минуты, после чего заливали шестикратным объемом стерильной дистиллированной воды и помещали в холодильник (при 4-10^oC) по крайней мере на 16 часов (оптимально 18-20 часов), после чего фильтровали через марлю на воронке Бюхнера. В результате получали 5,5 л фильтрата.

Фильтрат помещают в половолоконную установку ультрафильтрации (размер пор ), где проводят очистку при скорости подачи 100-150 л/час при давлении 0,8- 1,0 атмосфер до полного расхода жидкости. После вводят полиглюкин из расчета образования до конечной концентрации в фильтрате до 0,1±0,05% и подвергают раствор сублимационной сушке. Получают 25 г препарата с активностью 3-16⁶ ЕИА.

Полученный препарат стерилизуют, затем растворяют в воде до активности 3000 ЕИА/мл и помещают для созревания в холодильник при 4-6^o на 14-18 часов, после чего подвергают повторной стерилизующей фильтрации через мембраны с размером пор не менее 0,22 мк, сублимационно высушивают и фасуют.

Пример 2. Испытание специфической активности ингибитора пролиферации, получившего наименование "лимфотилин".

Влияние лимфотилина на синтез ДНК в лимфоцитах периферической крови доноров изучали в тесте РБТ, стимулированных ФГА клеток. Лимфоциты из плазмы крови выделяли в градиенте плотности фиколлверографина. Количество клеток в культуре 2 • 10⁶ кл/мл. Клетки культивировали в среде 199 с добавлением 15% активированной сыворотки человека группы АВ, стрептомицина (100 мкг/мл) и пенициллина (100 Е/мл). Концентрация ФГА в культуре составляла 4 мкг/мл. Клетки инкубировали в СО₂-инкубаторе при 37^o и 5% CO₂ в воздухе в течение 72 часов. Лимфотилин вводили в культуру одновременно с ФГА в начале инкубации. Были испытаны концентрации препарата от 0,1 ЕИА/мл до 500 ЕИА/мл ³Н-тимидин в концентрации 1 мкк/мл вносили в культуру за 6 часов до снятия проб. После культивирования клетки переносили на фильтры, отмывали и высушивали. Фильтры переносили в виалы с сцинцилляционной жидкостью для подсчета радиоактивности на счетчике Рак-Бета.

В результате исследований с помощью данного метода было выявлено ингибирующее влияние препарата на указанную реакцию. Ингибирующий эффект проявился в широком диапазоне концентраций (указанных выше) и составил от 45 до 86%
Влияние лимфотилина на синтез ДНК в трансформированных клетках периферической крови и костного мозга крыс и людей, больных лейкозами, изучали в культурах с использованием той же среды, что и при культивировании лимфоцитов периферической крови доноров. Количество клеток в культуре было равно 2 • 10⁶ в 1 мл.

Лимфотилин вносили в культуру клеток в начале инкубации и испытывали в концентрациях от 0,1 ЕИА/мл до 500 ЕИА/мл. Клетки костного мозга инкубировали в CO₂ инкубаторе при 37^o, 5% СO₂ в воздухе в течение 2-х часов, клетки крови в течение 2 и 21 часа. ³Н-тимидин вводили в культуру при краткосрочной инкубации вместе с лимфотилином, при суточной инкубации за 6 часов до снятия проб. Обработка клеток после инкубации проводилась так же, как и при постановке РБТ с лимфоцитами доноров.

По окончании срока инкубации во всех опытах проверяли жизнеспособность клеток в тесте с трипановым синим. Жизнеспособными были 987-100% клеток, взятых после культивирования.

Влияние лимфотилина на синтез ДНК в костномозговых клетках крыс определяли в широком диапазоне концентраций препарата (от 0,1 до 500 ЕИА). Результаты приведены в таблице 1. Данные показывают, что ингибирующее действие на гемопоэтические клетки лимфотилин проявляет во всех использованных концентрациях.

Пример 3. 1,2 кг лимфоузлов свиньи помещают в гомогенизатор при 4000 об/мин на 4 мин, после чего гомогенизат заливают шестикратным объемом стерильной дистиллированной воды и помещают в холодильник (при 4-10^oC) по крайней мере на 16 часов (оптимально 18-20 часов), после чего взвесь фильтруют на воронке Бюхнера через марлю. В результате получают 6-6,5 л фильтрата.

Берут 1,0 л фильтрата и помещают в ультрафильтрационную установку, в которой в качестве разделительных элементов используются плоские мембраны и мембраны в виде полых плоских волокон с различными средними размерами пор.

Процесс фильтрационной очистки ведут при тангенциальной скорости подачи раствора 0,25-0,35 м/сек, давлении 0,8-1,2 атм, комнатной температуре. После прохождения в фильтрат 0,9 л раствора опыт прекращают, отбирают 2 см³ интегрального фильтрата и определяют его биологическую активность по подавлению включения меченого тимидина в растущие клетки. Кроме того определяют пирогенность полученных образцов.

Результаты приведены в таблице 2.

Как видно из таблицы, положительные результаты получают при использовании мембран с размерами пор .

Пример 4. 100 г селезенки кролика помещают в гомогенизатор при 4000 об/мин на 4 мин, после чего гомогенизат заливают 600 мл дистиллированной стерильной воды и помещают в холодильнике при 4^oC на 20 часов, после чего взвесь фильтруют на воронке Бюхнера через марлю. В результате получают 0,55 л фильтрата, которые фильтруют на установке с полыми волокнами со средним размером пор при давлении 1±0,2 атм, тангенциальной скорости подачи раствора 0,3 м/сек. После прохождения в фильтрат 0,5 л раствора отбирают пробу, которую тестируют на биологическую активность и пирогенность. Полученный фильтрат апирогенен и имеет активность 120 ЕИА/мл.

Пример 5. 0,2 кг свиных лимфоузлов помещают в гомогенизатор при 4000 об/мин на 4 мин, после чего гомогенизат заливают дистиллированной водой в количестве 1,2 л помещают в холодильник на 20 часов, затем фильтруют через марлю, потом через полые волокна с размером пор в соответствии с условиями примера 1.

В 100 мл фильтрата растворяют навеску стабилизатора (в качестве которых используют полиглюкин, реополиглюкин, желатиноль и др.), полученный раствор лиофильно высушивают и перерастворяют в 20 мл апирогенной воды, выдерживают не менее 2 часов при пониженных температурах, стерильно разливают в ампулы по 1,0 мл и лиофильно высушивают.

Вскрывают одну ампулу, растворяют ее содержимое в 1 мл дистиллированной воды и испытывают на биологическую активность и проверяют присутствие механических включений.

В таблице 3 приведены результаты экспериментов.

Полученные результаты показали, что при осуществлении процесса в заявляемом интервале условий удается получить высокоактивный препарат, применяемый для медицинских целей.

В настоящее время по препарату "лимфотилин" оформлена документация в Ветфармкомитет. ТТТ1

Способ получения ингибитора клеточной пролиферации используется для получения высокоактивных лекарственных препаратов. Способ включает в себя гомогенизацию лимфоидных тканей животных, водную их экстракцию, очистку ультрафильтрацией на мембранах со средними размерами пор . Перед лиофилизацией в фильтрат вводят стабилизатор (полиглюкин, реополиглюкин, желатиноль), который обеспечивает образование защитного комплекса с активными центрами, до концентрации 0,05-1%, выдерживают не менее 2 часов, стерилизуют и готовят лекарственную форму. Проверка показывает апирогенность и высокую биологическую активность препарата. 3 з.п. ф-лы, 3 таб-цы.

1. Способ получения ингибитора клеточной пролиферации из лимфоидных тканей животных, включающий в себя их гомогенизацию, водную экстракцию активного начала, очистку, лиофилизацию и получение готового продукта, отличающийся тем, что очистку водного экстракта гомогената осуществляют ультрафильтрацией, а перед лиофилизацией в фильтрат вводят стабилизатор, раствор выдерживают не менее 2 ч перед финишной стерильной фильтрацией и сушкой. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ультрафильтрацию проводят на мембранах с размерами пор
3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что в качестве стабилизатора используют полиглюкин, реополиглюкин, желатиноль. 4. Способ по пп.1 и 3, отличающийся тем, что стабилизатор вводят в фильтрат до концентрации 0,05 1