СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСНОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА, СОДЕРЖАЩЕГО β -1,3-ГЛЮКАНАЗУ И ХИТИНАЗУ Российский патент 1995 года по МПК C12N9/36 

Изобретение относится к энзимологии и биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности для получения комплексного ферментного препарата, содержащего β -1,3-глюканазу и хитиназу, а также для получения каждого из названных ферментов по отдельности.

β -1,3-глюканолитические ферменты находят в настоящее время широкое применение при изучении строения клеточных стенок различных микроорганизмов, для образования протопластов грибов и растений, а также при разрушении клеток дрожжей для выделения из них разнообразных биологически активных веществ.

Хитинолитические ферменты также являются объектом углубленных исследований, поскольку во многом определяют пути превращений и утилизации хитина в природе. Важным является значение хитиназ как ферментов, способных расщеплять хитин в составе патогенных грибов. Вместе с тем, известно, что микроскопические грибы содержат в качестве основных структурных компонентов клеточной стенки и β-1,3-глюкан, и хитин. В связи с этим для эффективного разрушения клеток грибов и подавления их развития требуется сочетанное воздействие β-1,3-глюканазы, и хитиназы. При этом, наиболее предпочтительным является обработка комплексным препаратом, содержащим оба названных фермента. Тем самым, комплексные ферментные препараты, содержащие β-1,3-глюканазу и хитиназу (КФП), являются потенциальными противомикозными средствами и могут найти широкое применение в здравоохранении, ветеринарии и растениеводстве.

Известен ряд способов получения КФП. Все они сложны в исполнении и включают в себя стадии культивирования микроорганизма продуцента КФП в течение нескольких суток и стадии очистки фермента.

Известен способ получения КФП, включающий культивирование бактерий Sevvatia marcescens в течение нескольких суток в среде, содержащей в качестве источника углерода специально обработанный хитин, отделение нерастворимых компонентов центрифугированием, концентрирование целевого продукта ультрафильтрацией и очистку адсорбцией на коллоидном хитине с последующим гидролизом последнего и отделением продуктов гидролиза диализом [1]
Однако этот способ сложен, так как включает много стадий, в том числе стадию культивирования условно патогенного микроорганизма, и длителен, при этом в получаемом целевом продукте практически отсутствует β-1,3-глюканаза.

Известен также способ получения КФП, включающий культивирование бактерий Arthobacter luteus в течение суток в среде, содержащей в качестве источника углерода пекарские дрожжи, отделение нерастворимых компонентов центрифугированием и очистку хроматографией на специально синтезируемом сорбенте бензил-пахимане. Этот способ сложен, поскольку включает в себя стадию культивирования микроорганизма, при этом целевой продукт практически не содержит хитиназу [2]
Наиболее близким к заявляемому способу прототипом, является способ получения КФП [3] заключающийся в следующем. Выращивают посевной материал Streptomyces species в течение 12 сут. Готовят культуральную среду, содержащую следующие компоненты, г/л: фосфат калия однозамещенный 0,2, фосфат калия двузамещенный 0,8, сульфат аммония 0,5, сульфат магния 0,2, хлорид железа 0,01, хлорид кальция 0,01, сульфат цинка 0,01, хитин ракообразных 0,01. Среду для культивирования стерилизуют автоклавированием. Посевной материал стрептомицета вносят в культуральную среду. Культивирование стрептомицета осуществляют при температуре 30^оС в течение 5 сут. Культуральную жидкость отделяют от нерастворимых компонентов фильтрацией или центрифугированием.

КФП из культуральной жидкости выделяют известными способами: осаждают сульфатом аммония (90% насыщения) или сорбируют на "Целит", или хроматографируют на ДЕАЕ-целлюлозе.

Выход КФП: хитиназная активность (ХА) 0,04 ед. акт./л, β-1,3-глюканазная активность (ГА) 4,8 ед. акт./л культуральной жидкости.

Недостатки прототипа сложность (7 стадий с использованием специального оборудования и реактивов) и длительность (включая подготовительные работы, около 17 сут) способа.

Цель изобретения упрощение способа получения КФП.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве исходного сырья для получения КФП используют кормовой антибиотик "Кормогризин". Извлечение КФП из последнего осуществляют экстрагирующим раствором в соотношении "Кормогризин": экстрагирующий раствор, равном 1:(6-12) г/мл. Предпочтительно в качестве экстрагирующего раствора используют воду или 0,05-0,1 М раствор ацетата натрия (рН 5,5), а извлечение КФП осуществляют при температуре 15-25^оС в течение 30-120 мин.

Сущность предлагаемого способа заключается в следующем. Извлечение КФП из "Кормогризина" производят водой или 0,05-0,1 М раствором ацетата натрия (рН 5,5) в соотношении "Кормогризин":экстрагирующий раствор, равном 1:(6-12) (Г/мл), при температуре 15-25^оС в течение 30-120 мин. Экстракт, содержащий КФП, собирают центрифугированием или фильтрацией. КФП из экстракта получают известными способами: осаждают сульфатом аммония (80% насыщения),
или концентрируют ультрафильтрацией на полых волокнах, или хроматографируют на сефадексе G-100.

Выход КФП: ХА 0,48-0,6 ед. акт./г, ГА 4,8-6,0 ед. акт./г "Кормогризина". Длительность способа получения КФП, включая подготовительные работы, 1,0-1,5 сут.

Существенные отличительные признаки заявляемого способа по сравнению с прототипом следующие.

В качестве исходного сырья для получения КФП используют кормовой антибиотик "Кормогризин", что позволяет исключить сложные и длительные стадии культивирования продуцента и упростить способ по- лучения КФП за счет уменьшения количества стадий (на 4 стадии) и сокращения длительности способа (примерно в 10-15 раз). "Кормогризин" кормовой антибиотик, повышающий продуктивность сельскохозяйственных животных и снижающий уровень их заболеваемости (ТУ 59.04.070.38-81 с изм. 1). Его серийное тоннажное производство осуществляется на НПО "Восток" (п. Восточный, Кировская обл.), что позволяет решить проблему обеспечения производства КФП исходным сырьем. В связи с отсутствием стадии микробиологического культивирования получение КФП из "Кормогризина" не требует специального оборудования и реактивов и легко масштабируется. В случае необходимости хитиназа и β-1,3-глюканаза могут быть выделены из КФП в изолированном виде с применением традиционных биохимических методов [3]
В известных научно-технических источниках использование "Кормогризина" для получения КФП не обнаружено и его нельзя было предвидеть исходя из биологических и физико-химических свойств "Кормогризина". Более того, применяемая в технологии получения "Кормогризина" процедура высокотемпературной (140^оС) сушки делает маловероятной возможность наличия в нем каких-либо ферментов в активном состоянии. Извлечение КФП из "Кормогризина" производят экстрагирующим раствором в соотношении "Кормогризин":экстрагирующий раствор, равном 1:(6-12) (г/мл), что обеспечивает наибольший выход КФП.

На чертеже представлена зависимость выхода КФП от соотношения количеств "Кормогризина" и экстрагирующего раствора.

Кривая 1 описывает выход ГА, кривая 2 выход ХА. При уменьшении количества экстрагирующего раствора менее 6 мг/л "Кормогризина" выход и ГА, и ХА снижается более чем на 20% от максимального. Увеличение количества экстрагирующего раствора более 12 мг/л "Кормогризина" нецелесообразно, так как не приводит к дальнейшему повышению выхода КФП.

Для извлечения КФП из "Кормогризина" предпочтительно используют в качестве экстрагирующего раствора воду или 0,05-0,1 М раствор ацетата натрия (рН 5,5), при этом извлечение КФП из исходного сырья осуществляют при температуре 15-25^оС в течение 30-120 мин.

Экспериментально было установлено, что при использовании в качестве экстрагирующего раствора воды, фосфатов калия или натрия, ацетата натрия, цитрата натрия, трис-HCl или трис-ацетата в диапазоне рН 5,0-8,0 и извлечении КФП при температуре в диапазоне от 0^оС до 50^оС в течение 10-420 мин значимых различий в выходах КФП не наблюдается. Однако, исходя из соображений целесообразности, были выбраны наиболее предпочтительные режимы извлечения КФП из "Кормогризина". Вода является наиболее дешевым экстрагирующим раствором, тогда как 0,05-0,1 М ацетат натрия рН 5,5 более удобным, поскольку в этой же буферной системе проводится тестирование ГА и ХА и, тем самым, процедура анализа КФП в экстракте упрощается. Температура 15-25^оС в большинстве случаев соответствует комнатной, что позволяет при извлечении КФП не затрачивать дополнительных усилий по поддержанию температуры. Продолжительность процесса экстрагирования 30-120 мин отражает реальные затраты времени, особенно при увеличении масштабов выделения КФП из "Кормогризина".

Предпочтительный вариант использования изобретения позволяет получить дополнительный технический результат, заключающийся в наибольшей доступности используемых реактивов, возможности проведения процесса при комнатной температуре и последующего упрощения процедуры тестирования активности КФП.

В связи с тем, что использование существенных признаков заявляемого способа в известных научно-технических источниках не обнаружено, можно сделать вывод, что данное техническое решение обладает новизной и отвечает критерию "изобретательский уровень".

П р и м е р 1. 100 г "Кормогризина" суспендируют в 1000 мл дистиллированной воды и перемешивают в течение 90 мин при температуре 20^оС. После этого суспензию центрифугируют в течение 15 мин при 3000 об/мин. В надосадочной жидкости, содержащей КФП, определяют ГА и ХА. ГА определяют следующим образом. К 1,5 мл реакционной смеси, содержащей 1,5 мл ламинарина в 0,05 М ацетате натрия (рН 5,5), добавляют 0,05 мл надосадочной жидкости и инкубируют 30 мин при температуре 37^оС. После этого к реакционной смеси добавляют 1,5 мл реагента, содержащего: динитросалициловую кислоту 1,0, гидроокись натрия 1,0, фенол 0,25, сульфита натрия в воде 0,05. Смесь инкубируют в течение 15 мин при температуре 100^оС, добавляют 0,5 мл 40%-ного калия, натрия виннокислого и замеряют в ней оптическую плотность при длине волны 575 нм. По калибровочному графику определяют концентрацию глюкозы в реакционной смеси.

За единицу ГА принимают такое количество фермента, которое в приведенных условиях реакции образует 1 мкмоль/мл глюкозы в минуту. ХА определяют следующим образом. К 2 мл реакционной смеси, содержащей 15 мг хромогенного субстрата в 0,1 М ацетате натрия (рН 5,5), добавляют 1,0 мл надосадочной жидкости. После этого реакционную смесь инкубируют в течение 30 мин при температуре 37^оС и центрифугируют. В надосадочной жидкости измеряют оптическую плотность при длине волны 512 нм и по калибровочному графику определяют концентрацию N-ацетилглюкозамина в реакционной смеси. За единицу ХА принимают такое количество фермента, которое в приведенных условиях реакции образует 1 мкмоль/мл N-ацетилглюкозамина в минуту.

Выход КФП: ГА 600 ед. акт. ХА 60 ед. акт.

П р и м е р 2. Способ осуществляют аналогично примеру 1, за исключением того, что 100 г "Кормогризина" суспендируют в 600 мл 0,05 М раствора ацетата натрия (рН 5,5) и перемешивают в течение 120 мин при температуре 25^оС.

Выход КФП: ГА 480 ед. акт. ХА 48 ед. акт.

П р и м е р 3. Способ осуществляют аналогично примеру 2, за исключением того, что экстрагирующий раствор берут в количестве 1200 мл, а перемешивание осуществляют в течение 30 мин при температуре 15^оС.

Выход КФП: ГА 600 ед. акт. ХА 62 ед. акт.

П р и м е р 4. Способ осуществляют аналогично примеру 1, за исключением того, что надосадочную жидкость концентрируют ультрафильтрацией на ячейке с полыми волокнами типа АР 0,05 (предел пропускания 15 кДа) до объема 70 мл. В концентрате определяют ГА и ХА.

Выход КФП: ГА 90 ед. акт. ХА 55 ед. акт.

П р и м е р 5. 100 г "Кормогризина" суспендируют в 1000 мл воды и перемешивают при температуре 0^оС в течение 420 мин. После этого суспензию центрифугируют в течение 15 мин при 3000 об/мин. В надосадочной жидкости, содержащей КФП, определяют β-1,3-глюканазную (ГА) и хитиназную (ХА) активности.

Общий выход КФП: ГА 590 ед. акт. ХА 65 ед. акт.

П р и м е р 6. Способ осуществляют аналогично примеру 5, за исключением того, что перемешивание ведут при температуре 50^оС в течение 10 мин.

Общий выход КФП: ГА 600 ед. акт. ХА 62 ед. акт.

Использование: в биотехнологии и микробиологической промышленности. Сущность изобретения: b-1,3-глюканазу и хитиназу извлекают из кормового антибиотика "Кормогризин" водой или 0,05 0,1 М буферным раствором ацетата натрия, обеспечивающим pH 5,5, в количестве 6 12 мл/г "Кормогризина" при температуре 15 25°С в течение 30 120 мин. Экстракт собирают, содержащуюся в нем b-1,3-глюканазу и хитиназу очищают осаждением сульфатом аммония или концентрированием ультрафильтрацией на полых волокнах или хроматографией на сефадексе Г-100. Технический результат: сокращение числа стадий с 7 до 3, уменьшения длительности процесса в 10 15 раз. 2 з. п. ф-лы, 1 ил.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСНОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА, СОДЕРЖАЩЕГО β -1,3-ГЛЮКАНАЗУ И ХИТИНАЗУ, предусматривающий извлечение ферментов из исходного сырья, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют кормовой антибиотик "Кормогризин", а извлечение осуществляют экстрагирующим раствором при соотношении исходного сырья (г) и экстрагирующего раствора (л) 1:6-12 соответственно. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве экстрагирующего раствора используют воду или 0,05-0,1 М раствор ацетата натрия (рН 5,5), при этом извлечение комплексного ферментного препарата из исходного сырья осуществляют при 15-25^oС в течение 30-120 мин. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что комплексный ферментный препарат выделяют из полученного экстракта осаждением сульфатом аммония, или концентрированием ультрафильтрацией на полых волокнах, или хроматографией на сефадексе Г-100.