ШТАММ БАКТЕРИЙ SERRATIA MARCESCENS - ПРОДУЦЕНТ ХИТИНАЗЫ Российский патент 1995 года по МПК C12N9/36 C12N9/36 C12R1/43 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается штамма - продуцента фермента хитиназы. Хитинолитические ферменты, особенно хитиназа, обладают способностью расщеплять хитин в составе патогенных грибов и членистоногих. Хитиназы являются потенциальными противомикозными и энтомопатогенными препаратами и могут найти широкое применение в здравоохранении, ветеринарии и растениеводства. Поиск новых доступных и стабильных штаммов - продуцентов хитиназ, является актуальной народнохозяйственной задачей.

Известен штамм Streptomuces sp. WAK-83 - продуцент хитиназы [1]. Данный штамм выращивают на среде, содержащей дрожжевой экстракт (0,3%), полипептон (0,3%) глюкозу (0,2%) и коллоидный хитин (0,4%) при 28^оС в течение 3-4 сут. Затем культуральную жидкость осветляют центрифугированием и используют в качестве грубого препарата хитиназы с активностью 0,01 ед.акт./мл.

Недостатком известного штамма является низкая активность продуцируемой им хитиназы в препарате.

Известен также штамм Serratia marcescens IMR-IET - продуцент хитиназы [2] . Известный штамм получен ступенчатой селекцией из штамма S.marcescens QM 131466 после мутагенной обработки УФ-лучами с последующим воздействием этилметансульфонатом. Штамм выращивают на питательной среде, содержащей в качестве основных компонентов коллоидный хитин (1,5%) или кристаллический (2% ) хитин и дрожжевой экстракт (0,5 г/л) при 30^оС в течение 5 сут. Выход хитиназы в культуральной жидкости составляет 0,36 ед/мл.

Существенным недостатком известного штамма является его нестабильность, связанная с генетической природой мутации, а также недоступностью для широкого использования. Технической задачей изобретения является создание стабильного и доступного штамма, обеспечивающего высокий выход хитиназы.

Поставленная задача достигается применением в качестве штамма-продуцента хитиназы штамма Serratia marcescens В-10 М-1.

Данный штамм известен как продуцент эндонуклеазы [3] и получен из исходного музейного штамма Serratia marcescens В 10, под действием нитрозометилмочевины. Штамм Serratia marcescens В10 М-1 характеризуется следующими признаками:
Морфологические: клетки короткие палочки размером 0,8/3 0,6-0,8 мк, вытянутые, одиночные, парные или в цепочках, подвижные, грамотрицательны.

Культуральные: на питательном агаре через 48 ч роста при 30^оС образуют круглые, бесцветные, блестящие с гладкими краями колонии. Профиль колоний выпуклый.

Физиологические и биохимические: Штамм является ауксотрофом. Оптимальная температура роста 28-30^оС, рН среды 6-8.

Отношение к углеводам: ферментирует до кислотообразования глюкозу, сахарозу, мальтозу, маннит, не усваивает лактозу.

Желатину разжижает.

Молоко свертывает, но не пептонизирует.

Крахмал гидролизует очень слабо.

Клетчатку не разлагает.

Нитраты восстанавливает до нитритов.

Штамм Serratia marcescens В-10 М-1 хранится в коллекции ВКПМ ВНИИ генетика под регистрационным номером В-3273.

Для культивирования S. marcescens В-10 М-1 с целью получения хитиназы применяют питательную среду следующего состава, г/л воды: Хитин кристаллический 1,0-3,0 Дрожжевой экстракт 0,5 Сульфат аммония 0,1 Сульфат магния 0,3 Вода Остальное
Культивирование проводят на качалках со встряхиванием при 28-30^оС, рН 8,0-8,4, с аэрацией.

Выход хитиназы составляет 0,32-0,46 ед/мл культуральной жидкости.

Активность хитиназы определяют следующим образом. К 0,3 мл суспензии коллоидного хитина (10 мг/мл) добавляют 0,1 мл 0,5 м трис-уксусной кислоты (рН 6,5), аликвоту анализируемого препарата хитиназы, воду до конечного обеъма 1,0 мл и инкубируют при 37^оС в течение 30'. После этого реакционную смесь центрифугируют, а в надосадочной жидкости определяют концентрацию N-ацетилгликозамина с помощью динитросалицилового реагента (Miller G.L. Use of dinirtosalicilic acid reagent for determination of reducing sugar // Anal. Chem. - 1959. - V.31, N 3. - P.426-428). За единицу ХА принимают такое количество фермента, которое в описываемых условиях вызывает прирост концентрации N-ацетилгликозамина 1,0 мкмоль ˙ мин^-1 ˙ мл^-1.

В таблице представлена зависимость выхода хитиназы от времени выращивания продуцента на питательной среде, содержащей 2% кристаллический хитин.

Из таблицы видно, что предлагаемый в качестве продуцента хитиназы штамм не уступает известному штамму по выходу целевого продукта, а наиболее оптимальным является выращивание продуцента в течение 5-7 сут. Преимуществом предлагаемого штамма в качестве продуцента хитиназы является его стабильность при культивировании, доступность и высокий выход целевого фермента.

Известный суперпродуцент хитиназы - штамм S.marcescens IMK-IEI крайне нестабилен из-за генетической природы его сверх продуктивности - тандемной дупликации. В конце ферментации при выращивании на среде с хитином в клеточной популяции часто преобладают ревертанты с активностью хитиназы, подобной активности исходного штамма. Предлагаемый штамм S.marcescens В-10 - М-1 характеризуется генетической стабильностью в отношении продуктивности хитиназы. Стабильность последнего заложена в генетической природе мутации - сверхпродуктивности точечной плейотропной мутации, частота реверсии которой к исходному генотипу очень низка. Все испытанные клоны предлагаемого штамма сохраняли признаки мутантного генотипа и не изменяли продуктивности в отношении хитиназы.

В настоящее время отсутствуют доступные, высокопроизводительные штаммы - продуценты хитиназы.

П р и м е р 1. Культивирование штамма S.mercescens В-10 М-1 проводят на питательной среде следующего состава, г/л воды: Хитин кристаллический 3,0 Дрожжевой экстракт 5,0 Сульфат аммония 1,0 Сульфат магния 0,3 Вода до 1 л рН 8,5
Инкубацию со встряхиванием ведут при 30^оС в течение 7 дней. Культуральную жидкость отделяют центрифугированием. Выход хитиназы составляет 0,46 ед/мл в культуральной жидкости (КЖ).

П р и м е р 2. Получение КЖ осуществляют аналогично примеру 1. Для дополнительной очистки хитиназы к 100 мл КЖ добавляют сульфат аммония до концентрации 80% насыщения. Сформировавшийся осадок собирают центрифугированием, растворяют в 20 мл воды и диализуют против 5 л воды в течение 5 сут при -8^оС. В результате получают целевой продукт хитиназная активность (ХА) которого составляет 1,76 е.а./мл (пятикратная очистка по белку относительно исходной КЖ).

П р и м е р 3. Получение КЖ осуществляют аналогично примеру 1. Хитиназу из КЖ выделяют путем концентрирования на ячейках с полыми пористыми волокнами: для этого 150 мл КЖ концентрировали до 18 мл на ячейке с пределом пропускания 15 КДа. ХА целевого фермента составила 2,8 е.а./мл.

Использование предлагаемого штамма позволит расширить ассортимент штаммов - продуцентов хитиназы.

Предлагаемый штамм обладает преимуществами по сравнению с известными, а именно является доступным, стабильным, обеспечивает высокий выход хитиназы.

Использование: микробиология, биотехнология, сельское хозяйство. Сущность изобретения: в качестве продуцента хитиназы предложен известный штамм Serratia marcescens (B.prodigiosum) В-10 м-1 (ВКПМ В-3273), растущий на доступной дешевой среде, стабильный при хранении. Выход хитиназы составляет 0,3 - 0,5 ед/мл культуральной жидкости. Получение доступного стабильного штамма обеспечивает расширение ассортимента штаммов продуцентов хитиназы. 1 табл.

ШТАММ БАКТЕРИЙ SERRATIA MARCESCENS - ПРОДУЦЕНТ ХИТИНАЗЫ.

Применение штамма бактерий Serratia marcescens ВКПМ В-3273 в качестве продуцента хитиназы.