Способ получения хромогенного субстрата для определения хитиназной активности Советский патент 1993 года по МПК C12Q1/34 C12N9/42 

В

oche. 1964, v.8, № 3, p.397-401.

Использование: энзимология, микробиологическая промышленность в качестве субстрата для определения хитиназной активности в ферментных препаратах и биологических средах. Сущность изобретения: осуществляют окрашивание коллоидного хитина тиазиновым или винилсульфоновым красителем в растворе, содержащем гидро- ксил-ионы в концентрации 0,1-0,25 М, путем инкубирования реакционной смеси при 100°С в течение 10-30 мин. При этом краситель преимущественно берут в концентрации 10-15 мас.%. 1 з.п.ф-лы, 4 ил.

Изобретение относится к способам пол- ния окрашенных соединений и может быть использовано в энзимологии, микробиологической промышленности в качестве субстрата для определения хитиназной ак- . тивности в ферментных препаратах и биологических средах.

Хитинолитические форменты являются объектом углубленных исследований, поскольку во многом определяют пути превра- иений и утилизации хитина в природе, Не менее важным является значение хитиназ, KIIK ферментов, способных расщеплять хитин в составе патогенных грибов и насеко- м ых. Тем самым, хитиназы (или композиции нэ их основе) являются потенциальными эн- т эмопатогенными и гфотивомикозными п эепаратами. В связи с изложенным, разработка аналитических способов для идентификации и тестирования хитиназ является актуальной.

Известен ряд способов анализа хитиназной активности. Все они основаны на определении растворимых продуктов расщепления хитина хитиназами. Однако боль- шинство из эт и способов обладает существенными недостатками: низкой чувствительностью, недостаточной специфичностью, а также использованием при подготовке и проведении анализа высокотоксичных или радиоактивных соединений.

Наиболее простыми и специфичными являются способы тестирования активности хитиназ с использованием хромогенных субстратов, в которых исходные полимеры хитина модифицируют (окрашивают) хромоXI Ю

hO N

го

00

Сл)

генными группировками. Результаты анализа хитиназной активности определяют после окончания хитиназной реакции по оптической плотности фильтратов реакционных смесей.

Известен, например, способ получения хромогенного субстрата путем модификации полиглюканов (пуллулана, крахмала) триазиновыми или винилсульфоновыми красителями в присутствии сульфата натрия и ортофосфата натрия в течение 2 часов при температуре 50°С.

Однако такой субстрат для определения хитиназТШ й активности непригоден, поскольку не расщепляется хитинолитически- ми ферментами.

Наиболее близким к заявляемому способу - прототипом, является способ получения хромогенного субстрата для анализа хитиназной активности, заключающийся в следующем.

Взвешивают 1 г порошка нативного хи- тина, просеянного через сито 200 меш; к навеске хитина добавляют 50 мл 1%-ного раствора триазинового (Процион красный Ж) или винилсульфонового (Ремазол ярко- голубой Р или Ремазол ярко-фиолетовый 5Р) красителя в Ш NaOH; полученную суспензию инкубируют 5 мин при температуре 100°С (на кипящей водяной бане); после этого суспензию инкубируют ночь при комнатной температуре; после, этого окрашенный хитин промывают дистиллированной водой для удаления несвязанного красителя; после этого окрашенный хитин про- мывают дополнительно этанолом и диэтиловым эфиром; после этого окрашенный.хитин высушивают и используют как хромогенный субстрат для анализа хити- наз..

Хромогенные субстраты для анализа хи- тиназ производятся по способу-прототипу фирмами США Сигма и Калбиохем,

Данный хромогенный субстрат характеризуется эффективностью 0,036. Длитель- ность процедуры синтеза - 10-12 часов. Эффективность хромогенного субстрата определяют следующим образом. Реакционную смесь, содержащую хромогенный субстрат (3 мг/мл) и хитиназу из Streptomyces griseus (0,2 мг/мл) в 0.05М ацетатном буферном растворе (рН 5,5) инкубируют при температуре 25°С в течение 18 часов. После этого реакционную смесь центрифугируют (3000 об/мин, 10 мин), надоса- дочную жидкость собирают. Оптическая плотность надосадочной жидкости при длине волны, характерной для используемого красителя, является эффективностью хромогенного субстрата.

Основным недостатком прототипа явля ется низкая эффективность хромогенного субстрата. Для увеличения эффективности субстрата в прототипе предлагается использовать в качестве исходного полимера вместо альфа-формы хитина его гамма-форму, которая быстрее расщепляется хитиназами. Такое решение нельзя признать удовлетворительным, поскольку в природе встречается в основном альфа-форма хитина, а гамма-хитин обнаружен только в коконах некоторых жуков и в панцырях отдельных видов моллюсков. В связи с этим, гамма-хитин труднодоступен и не может найти повсеместное применение.

Дополнительным недостатком прототипа является многостадийность и длительность способа синтеза хромогенного субстрата.

Целью изобретения является увеличение эффективности хромогенного субстрата и упрощение способа его синтеза.

Это достигается тем, что в качестве исходного полимера используют коллоидный хитин, который модифицируют триазино- вым или винилсульфоновым красителем в растворе, содержащем гидроксид-ионы в концентрации 0,1-0,25М, путем инкубиро- вания реакционной смеси при температуре 100°С в течение 10-30 мин. При этом краситель преимущественно берут в концентрации 10-15%.

Сущность предлагаемого способа заключается в следующем:

к коллоидному хитину добавляют раствор, содержащий гидроксил-ионы в концентрации 0,1-0,25М и триазиновый или винилсульфоновый краситель в концентрации 10-15%;

полученную суспензию инкубируют на кипящей водяной бане при температуре 100°С в течение 10-30 мин;

окрашенный хитин отмывают дистиллированной водой от несвязавшегося красителя и используют в качестве хромогенного субстрата для анализа хитиназной активности.

Получаемый хромогенный субстрат в за- висимсти от вида используемого красителя характеризуется эффективностью 0,55-1,2. Длительность процедуры синтеза составляет 30-40 мин,

Существенными отличительными признаками заявляемого способа по сравнению с прототипом являются следующие.

В качестве исходного полимера используют не нативный, а более гидрофильный коллоидный хитин, что позволяет увеличить эффективность хромогенного субстрата в 10-13 раз. Коллоидный хитин значительно

белее чувствителен к действию хитиназ, чем нативный хитин. При этом, повышенная гидрофильность позволяет более эффективно модифицировать коллоидный хитин молекулами красителя. Хромогенный субстрат, по пученный из коллоидного хитина в условиях прэтотипа, обладает эффективностью 0,3-0,4. В известных научно-технических источниках ис юльзование коллоидного хитина в качестве ис (одного полимера для модификациитриази- нозыми или винилсульфоновыми красителями с ;елыо получения хромогенного субстрата дл 1 тестирования хитиназной активности не обнаружено.

Модификацию хитина проводят в растворе, содержащем гидроксил-ионы с концентрацией 0,1-0,25М, что позволяет повысить эффективность хромогенного суб- ст ата, по сравнению с прототипом, в 1,5 раза. На фиг.1 представлена зависимость от носительной эффективности хромогенного субстрата от параметра рХ, где рХ опре- детяется из концентрации гидроксил-ионов (Сон-) по формуле: рХ - 14 + lg Сон-. Из фиг.1 вицно, что при значениях рХ меньше 13 (Сон- 0.1М) и больше 13.4 (Сон- 0,25М) эффективность хромогенного субстрата сн лжается более, чем на 10% от максимально л (Сон- 0,15М). Представленная на фиг.1 зазисимость воспроизводится при исполь- зозании в качестве источника гидроксил- ионов различных гидроокисей (калия, нагрия, лития). В известных научно-технических источниках использование заявляемого диапазона концентраций гидроксил-ионов дл 1 модификации молекул хитина триазино- выми или винилсульфоновыми красителями не обнаружено.

Длительность инкубирования реакционной смеси при температуре 100°С (на кипя цей водяной бане) составляет 10-30 мин, что позволяет увеличить эффективность хрэмогенного субстрата, по сравнению с прототипом, еще в 1,25 раза и упростить сп эсоб получения хромогеннного субстрата дл ч тестирования хитиназ за счёт сокращения количества стадий (на 4 стадии), сокра- ще ния длительности синтеза хромогенного субстрата с 10-12 часов до 30-40 мин, а также исключения из способа пожароопас- ных реагентов (этанола, диэтилового эфира.

На фиг.2 представлена зависимость от- но;ительной эффективности хромогенного субстрата от продолжительности инкубиро- ва ния реакционной смеси при температуре 10)°С. На фиг.2 видно, что сокращение про- до жительности инкубирования менее 10 мин приводит к уменьшению эффективности хромогенного субстрата более, чем на

10% от максимального значения (при длительности инкубирования 25-30 мин). Увеличение продолжительности инкубирования более 30 мин нецелесообразно, поскольку не 5 приводит к дальнейшему повышению эффективности хромогенного субстрата. Послз проведения синтеза хромогенного субстрата в заявляемых условиях, дополнительного инкубирования реакционной

0 смеси при комнатной температуре в течение ночи, как предлагается в прототипе, не требуется. Дополнительное инкубирование реакционной смеси при комнатной температуре в течение 0-18 часов не изменяет

5 эффективности заявляемого хромогенного субстрата.

В известных научно-технических источниках использование заявляемой продолжительности инкубирования реакционной

0 смеси при температуре 100°С для модификации хитина триазиновыми или винилсульфоновыми красителями не обнаружено.

Триазиновый или винилсульфоновый краситель преимущественно используют в

5 концентрации 10-15%, что позволяет получить дополнительный положительный эффект, заключающийся в увеличении эффективности хромогенного субстрата в 1,5-2,5 раза. Уменьшение концентрации

0 красителя ниже 10-15% приводит к снижению эффективности хромогенного субстрата. Увеличение концентрации красителя выше 10-15% нецелесообразно, поскольку указанная концентрация близка к насыща5 ющей для данных красителей и ее дальнейшее повышение затрудняет отмывку хромогенного субстрата от несвязавшегося красителя и, тем самым, усложняет способ получения.хромогенного субстрата для тес0 тирования хитиназ.

На фиг.З представлены сравнительные данные по эффективности заявляемых хро- могенных субстратов (1-4) и эффективности прототипа (5), где для синтеза хромогенных

5 субстратов использовали: 1 - триазиновый краситель Реактив красный 4 (фирмы Сигма); 2 - триазиновый краситель Про- цион ярко-голубой М-Р (фирмы Серва); 3

- винилсульфоновый краситель Ремазол 0 ярко-фиолетовый 5Р (фирмы Сигма); 4 и 5

-триазиновый краситель Реактив красный 120 (фирмы Сигма). Из фиг.З видно, что заявляемые хромогенные субстраты, полумаемые с разными красителями, отлкчают- 5 ся между собой по эффективности не более, чем в 2 раза. Такой разброс эффективно- стей, по-видимому, отражает различия красителей в спектральных свойствах и реакционных способностях. Тем не менее, все заявляемые хромогенные субстраты в

15-30 раз превышают по эффективности субстрат, полученный в условиях прототипа.

На фиг.4 представлен линейный участок зависимости скорости гидролиза заявляемого хромогенного субстрата, модифицированного Реактивом красным 120, от концентрации препарата хитиназы из Streptomyces griseus. Условия гидролиза: концентрация хромогенного субстрата 3 мг/мл в 0.05М ацетатном буферном растворе рН 5,5, температура 50°С, продолжительность реакции 30 мин. Из фиг.4 видно, что заявляемый хромогенный субстрат позволяет определять хитиназную активность в широком диапазоне концентраций фермента.

П р и м е р 1. К пасте коллоидного хитина, содержащей 1 г основного вещества (в пересчете на сухой вес), добавляют 100 мл 10%-ногс триазинового красителя Реактив красный 120 в 0.15М КОН и инкубируют в течение 30 мин при температуре 100°С (на кипящей водяной бане). После окончания инкубирования осадокюкрашенного хитина собирают центрифугированием (3000 об/мин, 10 мин) и промывают дистиллированной водой для удаления несвязавшегося красителя. К отмытому хромогенному субстрату добавляют дистиллированную воду, доводя общий объем суспензии до 100 мл (концентрация хромогенного субстрата около 10 мг/мл). Эффективность хромогенного субстрата - 1,2. Суспензию хромогенного субстрата хранят в темноте при температуре 4-8°С е течение нескольких месяцев.

П р и м е р 2. Получение хромогенного субстрата осуществляют аналогично примеру 1, но окрашивание производят винил- сульфоновым красителем Ремазолом ярко-фиолетовым 5Р с концентрацией 15% в 0.15М NaO.H. Эффективность хромогенного субстрата - 1,05.

П р и м е р 3. Получение хромогенного субстрата осуществляют аналогично примеру 1, но модификацию коллоидного хитина производят в 0.25М NaOH. Эффективность хромогенного субстрата - 1,08.

П р и м е р 4, Получение хромогенного субстрата осуществляют аналогично примеру 1, но модификацию коллоидного хитина производят в 0,1М КОН. Эффективность хромогенного субстрата - 1,08.

П р и м е р 5. Получение хромогенного субстрата осуществляют аналогично приме-. ру 1, но реакционную смесь инкубируют в течение 10 мин. Эффективность хромогенного субстрата - 1,05.

П р и м е р б. Определение хитиназной активности (ХА) с помощью заявляемого хромогенного субстрата.

В две пробирки приливают по 1 мл 1 %- ной суспензии хромогенного субстрата, полученного по примеру 1, по 0,6 мл 0.25М ацетатного буферного раствора (рН 5,5) и

1,25 мл дистиллированной воды. В одну пробирку (тест-проба) приливают 0,15 мл раствора ферментного препарата хитиназы из Streptomyces griseus с концентрацией 0,5 мг/мл. В другую пробирку (контрольная

проба) приливают 0,15 мл дистиллированной воды. Обе пробирки инкубируютс периодическим перемешиванием в течение 30 мин при температуре 50°С. После этого обе пробы центрифугируют (3000 об/мин, 10

мин). Надосадочные жидкости собирают и измеряют в тест-пробе против контрольной пробы оптическую плотность при длине волны 512 нм. ХА определяют по формуле

20

ХА

A-V

где А - оптическая плотность в тест-пробе при длине волны 512 нм (А 0,4);

V - объем реакционной смеси, мл (V - Змл);

Р - количество ферментного препарата, мг(Р 0,075мг);

Т - продолжительность реакции, мин (Т

30 мин);

К - коэффициент пересчета оптической плотности в концентрацию N-ацетилглюко- замина, мкмоль (К 1,6 мкмоль 1).

За единицу ХА принимают такое количество фермента, которое в приведенных условиях реакции образует 1 мкмоль М-аце- тилглюкозамина в минуту. ХА ферментного препарата хитиназы из Streptomyces griseus составляет 0,33 ед.акт./мг.

Пример, Определение ХА осуществляют аналогично примеру 6, но используют хромогенный субстрат, полученный по примеру 2, оптическую плотность измеряют при длине волны 560 нм (А 0,36), а коэффициент К принимают равным 1,4 мкмоль 1, ХА составляет 0,34 ед.акт./мг.

Примерб. Определение ХА осуществляют аналогично примеру 6, но в качестве тестируемого препарату используют хитиназу из Serratia marcescens. A 0,26. ХА ферментного препарата хитиназы из Serratia marcescens составляэт 0,22 ед.акт./мг.

П р и м е р 9. Определение ХА осуществляют аналогично примеру 7, но в качестве

тестируемого препарата используют хити- назу из Serratia marcescens. A 0,23. ХА составляет 0,22 ед.акт./мг.

Использование предлагаемого способа позволит по сравнению с прототипом

увеличить эффективность хромогенного

субстрата в 15-30 раз;

упростить способ получения хромогенного

субстрата за счет: а) сокращения количества стадий (на 4

стёдии); б) сокращения длительности синтеза

хромогенного субстрата с 10-12 часов до

30J-40 мин;

в) исключения из способа пожароопасньх реагентов (спирт, эфир).

Формула изобретения

полимера триазиновым или винильсуфоно1020 30 Врем.мин . Фиг.2

0

5

вым красителем в растворе, содержащем гидроксил-ионы, инкубирование реакционной смеси при 100°С и отделение несвязавшегося красителя промыванием, отличающийся тем, что, с целью увеличения эффективности целевого продукта и упрощения способа его получения, в качестве исходного полимера используют коллоидный хитин, модифицированный красителем в растворе, содержащем гидроксил-ионы в концентрации 0,1-0,25 М, а инкубирование реакционной смеси осуществляют в течение 10-30 мин.

12

13 W 14 рХ

Г Z .3 Ч 5