СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНЕРАЦИИ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА ЛЕЙКОЦИТАМИ Российский патент 1995 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к медицине, в частности к способам определения генерации активных форм кислорода лейкоцитами (фагоцитами: гранулоцитами и моноцитами). Генерация активных форм кислорода лейкоцитами усиливается при различных заболеваниях и поэтому предлагаемый способ может быть использован в различных областях медицины: кардиологии, гастроэнтерологии, пульмонологии, а также в отделениях интенсивной терапии для диагностики и оценки тяжести заболевания.

Доказано, что нарастание генерации активных форм кислорода играет важную роль в патогенезе ишемической болезни сердца, бронхиальной астмы, язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, системой склеродермии и системной красной волчанки и поэтому отражает тяжесть их развития.

Известен способ определения генерации активных форм кислорода лейкоцитами по модифицированной методике Миллз Е.Л. и Куи П.Г. из гепаринизированной крови 8-10 мл с помощью последовательного центрифугирования при 500 и 1000 об/мин выделяли общую лейкоцитарную массу и ресуспендировали в собственной плазме или физиологическом растворе (рН 7,35) в концентрации 2,5-2 тыс. клеток в 1 мм³. Для потенционирования хемилюминесценции (ХЛ) к 200 мкл суспензии лейкоцитов добавляли изоосмолярный насыщенный водный раствор люминола 20 мкл с рН 7,35. Измеряли хемилюминесценцию до выхода свечения на "плато" это базальная хемилюминесценция, затем измеряли стимулированную хемилюминесценцию, добавляя для этого 200 мкл опсонизированного зимозана. Недостатком этого способа является длительность исследования, использование большого объема крови, взятой из вены.

Предлагаемое изобретение обеспечивает снижение тpавматичности способа за счет уменьшения объема отбираемой крови и исключения операции по отбору венозной крови.

Способ определения генерации активных форм кислорода лейкоцитами в малом объеме крови включает приготовление взвеси лейкоцитов в плазме, подсчет в ней концентрации лейкоцитов и определение базальной люминолзависимой и стимулированной двуокисью кремния хемилюминесценции лейкоцитов в одной и той же пробе.

Способ осуществляется следующим образом: проводят забор 0,4 мл капиллярной крови, выделяют лейкоциты центрифугированием при 700 об/мин в пластмассовых капиллярах с внутренним диаметром 2,0 мм в течение 5 мин, при этом кровь разделяется на 3 слоя, верхний и средний слои (слой плазмы и лейкоцитарный слой) необходимо собрать. Далее подсчитывают лейкоциты (гранулоциты и моноциты) в камере Горяева и измеряют базальную хемилюминесценцию, для этого к 50,0 мкл взвеси лейкоцитов в плазме добавляют 20,0 мкл насыщенного изосмолярного водного раствора люминола с рН 7,35. Затем измеряют стимулированную хемилюминесценцию добавлением 0,02 мл 0,5%-ной суспензии в физраствор, рН 7,25 SiO₂. Приводим конкретные примеры выполнения.

П р и м е р 1. У донора мужчины 32 лет, группа крови II, Rh(+), взяли из пальца 0,4 мл крови в пробирку с 0,1 мл раствора гепарина, полученного добавлением к 0,3 мл стандартного фармакопейного раствора гепарина (1 мл 5000 ед. ) 2,5 мл физраствора с рН 7,35. Кровь центрифугировали в течение 5 мин при 700 об/мин в пластмассовых капиллярах с внутренним диаметром 2,0 мм, один конец которых закрывается пластмассовой пробкой. При этом кровь разделилась на 3 слоя: верхний и средний осторожно собрали с помощью шприца для введения инсулина с присоединенной к нему тонкой пластмассовой трубочкой. Далее провели подсчет лейкоцитов и исследовали показатели ХЛ лейкоцитов на хемилюминометре фирмы LKB-WALLAC, модель 1251. ХЛ образцов определяли в режиме последовательного измерения в мВ/с: 1) при 37^оС измеряли свечение пустой кюветы; 2) в нее добавили 0,05 мл взвеси лейкоцитов в плазме измерение спонтанной ХЛ клеток; 3) далее добавили 0,02 мл насыщенного изоосмолярного водного раствора люминола (фирмы Boeringer Mannheim) с рН 7,25; Измеряли ХЛ каждые 10-15 мин, до выхода свечения на "плато". ХЛ, измеренная таким образом, называется базальной; 4) затем в кювету добавили 0,5%-ную суспензию SiO₂, а также измеряли ХЛ через каждые 10-15 мин до выхода на "плато" это стимулированная ХЛ; 5) рассчитывали показатели интенсивности ХЛ стандартного количества лейкоцитов 1 х 106 (ПИХЛ), базальный и стимулированный, по формуле:
максимальные цифры ХЛ ПИХЛ= --------------------------------------------х 10⁶
количество лейкоцитов (фаго-
цитов:гранулоцитов и моноцитов)
в исследуемом объеме Коэффициент 10 введен для удобства расчетов в связи с малой исходной величиной ПИХЛ. Результаты: ПИХЛ базальный 7,38 мВ/с (норма 2,9-24,8 мВ/с)
ПИХЛ стимулированный 27,87 мВ/с (норма 26,9-42,2 мВ/с)
П р и м е р 2. Больная Л. 45 лет, история болезни N 7434. Клинический диагноз: ИБС. Стенокардия напряжения 111 ф. к. средней степени тяжести. Постинфакрктный кардиосклероз. Атеросклероз венечных артерий сердца. НК 11 Б.

10 лет назад перенесла инфаркт миокарда передней стенки левого желудочка, после чего стали возникать сжимающие боли за грудиной при быстрой ходьбе, иррадирующие в левую руку, проходящие после приема нитроглицерина: беспокоили одышка и пастозность голеней. Постоянно принимает пролонгированные нитраты, антагонисты кальция, мочегонные. Госпитализирована по поводу учащения приступов стенокардии, усиления одышки.

При осмотре: гиперстенического телосложения, кожные покровы и видимые слизистые обычной окраски, пастозность голеней, лимфатическая и костно-мышечная системы не изменены. При аускультации легких: дыхание везикулярное, с жестким оттенком, хрипы не выслушиваются. ЧД-20/мин. Область сердца не изменена, левая граница сердца по левой среднеключичной линии. Тоны сердца приглушены, ритмичны, систолический шум над верхушкой сердца и аортой. АД 135/90 мм рт. ст. ЧСС 86 уд./мин. Живот мягкий, безболезненный. Печень выступает на 1,5 см из-под края реберной дуги. Результаты:
ПИХЛ базальный 56,6 мВ/с (норма 2,9-24,8 мВ/с).

ПИХЛ стимулированный 147,4 мВ/с (норма 26,9-42,2 мВ/с)
При выписке: ПИХЛ базальный 16,8 мВ/с (в пределах нормы)
ПИХЛ стимулированный 40,8 мВ/с (в пределах нормы)
П р и м е р 3. Больной К. 39 лет, слесарь, история болезни N 1127. Диагноз: Язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки в стадии обострения, средней степени тяжести.

Поступил в клинику с жалобами на боли в подложечной области, возникающие по ночам и спустя 30-40 минут после приема пищи, изжогу, тошноту.

Из анамнеза известно, что язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки страдает в течение 5 лет, с обострениями заболевания 1-2 раза в год. Во время последнего обострения в течение двух недель самостоятельно принимал альмагель, гастрофарм, но-шпу без эффекта. Направлен в клинику для обследования и лечения.

При поступлении: объективно нормостенического телосложения, умеренного питания. Кожные покровы и видимые слизистые обычной окраски. Лимфатическая и костно-мышечная системы не изменены. Со стороны легких и сердечно-сосудистой системы патологии не выявлено. АД 110/75 мм рт. ст. Пульс 62 уд/мин. Язык обложен белым налетом. Живот активно участвует в акте дыхания. При пальпации локальная болезненность в эпигастральной области, без иррадиации. Печень и селезенка не пальпируются. С-м Пастернацкого отрицательный.

ЭГДС: на передней стенке желудка язва 1,0 см в диаметре с выраженным воспалительным валом.

Результаты:
ПИХЛ базальный 41,4 мВ/с (норма 2,9-24,8 мВ/с)
ПИХЛ стимулированный 147,3 мВ/с (норма 26,9-42,2 мВ/с)
При выписке: ПИХЛ базальный 20,4 мВ/с (в пределах нормы)
ПИХЛ стимулированный 38,7 мВ/с (в пределах нормы)
В настоящее время метод определения генерации активных форм кислорода лейкоцитами внедряется в практику при исследовании различных болезней (ИБС, язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, бронхиальной астме). В перспективе внедрение этого метода будет возрастать, поскольку доказано, что генерация активных форм кислорода лейкоцитами имеет диагностическое и патогенетическое значение. Однако, препятствием для этого является использование большого объема крови (10,0 мл), забираемой из локтевой вены. Предлагаемый нами способ лишен этого недостатка.

При использовании методики V.L. Tomas et al. можно получить искаженные результаты базального показателя интенсивности хемилюминесценции, так как лейкоциты подсчитывают в цельной крови, а показатель интенсивности хемилюминесценции рассчитывают на 1 лейкоцит лейкоцитарной массы (количество лейкоцитов цельной крови может быть иным, чем в измеряемой лейкомассе). Погрешность можно также получить при измерении хемилюминесценции лейкоцитов, взвешенных в искусственной среде хемилюминесцентном буферном растворе.

Способ определения генерации активных форм кислорода лейкоцитами в малом объеме крови, включающий исследование показателей хемилюминесценции лейкоцитов, заключающейся в том, что готовят взвесь лейкоцитов в плазме, подсчитывают в ней концентрацию лейкоцитов и определяют базальный люминолзависимый и стимулированный SiO₂ показатель интенсивности хемилюминесценции в одной и той же стандартной пробе. По отклонениям от нормы судят о патологическом состоянии организма. В норме показатели интенсивности хемилюминесценции:
базальный 2,9 24,8 мВ/с,
стимулированный 26,9 42,2 мВ/с.

Способ используется в медицине, диагностике, для определения генерации активных форм кислорода лейкоцитами в малом объеме крови. Сущность изобретения: готовят взвесь лейкоцитов в плазме, подсчитывают в ней концентрацию лейкоцитов и определяют последовательно в одной и той же стандартной пробе базальный люминолзависимый и стимулированный двуокисью кремния показатель хемилюминесценции лейкоцитов. Способ позволяет с достаточной точностью определить показатели хемилюминесценции для диагностики патологического состояния организма и степень его тяжести.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНЕРАЦИИ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА ЛЕЙКОЦИТАМИ, включающий отбор крови, отделение лейкоцитов, ресуспендирование их в собственной плазме с последующей регистрацией базальной люминолзависимой и стимулированной хемилюминесценции, отличающийся тем, что отбирают капиллярную кровь, отделение лейкоцитов проводят центрифугированием в капиллярах диаметром 2 мм, а в качестве стимулятора хемилюминесценции используют двуокись кремния.