СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ СТЕНОКАРДИИ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к медицине, конкретно к кардиологии, и может быть использовано для определения степени тяжести заболевания.

Известны способы определения степени тяжести стенокардии по клинической картине (частота возникновения приступов стенокардии, зависимость их возникновения от физической нагрузки), то есть оценка функциональных классов, и по результатам пробы с физическими нагрузками (велоэргометрия, тредмил). Недостатком указанных способов является их неточность, так как они утрачивают свое значение при ухудшении течения заболевания, особенно при нестабильной стенокардии, что приводит к назначению неадекватного лечения больному.

Известен способ определения степени тяжести стенокардии, основанный на оценке адгезионно-агрегационных функций тромбоцитов. Эта оценка проводится по способности тромбоцитов к адгезии и агрегации тромбоцитов на фильтрах. При этом готовят плазму, богатую тромбоцитами, для чего центрифугируют кровь больного при 1000 об/мин в течение 10 мин, супернатантом (надосадочной частью) является плазма богатая тромбоцитами. Затем плазму больного пропускают через фильтр (коллагенновую губку) и подсчитывают с помощью целоскопа количество тромбоцитов до и после пропускания плазмы больного. Количество оставшихся на фильтре тромбоцитов выражается в процентах по отношению к норме (у здоровых доноров) и отражает адгезионно-агрегационные свойства тромбоцитов, увеличение которых свидетельствует о нарастании степени тяжести стенокардии. Недостатком этого способа является его неточность, большой разброс данных, необходимость отработки нормы на крови здоровых доноров для каждого нового фильтра.

Известен также способ оценки степени тяжести стенокардиипо агрегационным свойствам тромбоцитов, которую проводят путем измерения разницы в оптической плотности плазмы больного богатой тромбоцитами до и после введения в нее агрегирующих агентов. Исследование проводят фотометрическим методом на агрегометре.

Недостатком этого способа является его сложность; что определяется длительностью исследования, а также недостаточно высокая точность метода так как велик разброс данных в норме и при стенокардии.

Известен способ оценки степени тяжести стенокардии путем измерения в крови уровня продуктов перекисного окисления липидов (малонового диальдегида) и измерения методом люминолзависимой хемилюминесценции количества активных форм кислорода, генерируемых лейкоцитами.

О количестве активных форм кислорода судят по интенсивности хемилюминесценции лейкоцитов в покое (температур 25^oC и при стимуляции температурой (Т-37^o). Исследование проводят на хемилюминометре, рассчитывается показатель хемилюминесценции (ПИХЛ) по формуле:

Недостатком данного способа является недостаточная его достоверность, так как не учитывается роль тромбоцитов в развитие стенокардии и их влияние на свободнорадикальные процессы, кроме того данный способ определяет только стабильную и нестабильную стенокардию.

Данный способ принят нами за прототип-базовый объект, как совпадающий по наибольшему количеству признаков с предлагаемым способом.

Целью настоящего предложения является повышение точности определения степени тяжести стенокардии.

Для достижения поставленной цели предлагается способ определения степени тяжести стенокардии, включающий исследование крови больного с последующим определением количества активных форм кислорода, при этом к одной порции лейкоцитарной взвеси стандартной концентрации добавляют плазму бедную тромбоцитами, полученную из крови больного (ПБТ), а к другой порции добавляют плазму того же больного, обогащенную тромбоцитами (ПОТ) с последующим определением уровня активных форм кислорода, генерируемых лейкоцитами. Далее вычисляют показатель ингибирующей активности тромбоцитов (ПИТ) по формуле:

ПОТ плазма обогащенная тромбоцитами
ПБТ плазма бедная тромбоцитами
ПИХЛ показатель интенсивности хемилюминесценции лейкоцитов, вычисляемый по формуле:

При этом уменьшение показателя ингибирующей активности тромбоцитов по отношению к норме, вычисленной у здоровых людей по той же формуле, свидетельствует о нарастании степени тяжести стенокардии.

Так при значении ПИТ от 28,2% до 40% I-я степень тяжести стенокардии, при значении ПИТ ниже 28,2% степень тяжести стенокардии II. У доноров значение ПИТ колеблется от 40% до 50%
Пример 1. Больной Н. 49 лет поступил в клинику с жалобами на сжимающие боли за грудинкой, купирующиеся приемом нитроглицерина через 1-2 мин, возникающие при физической нагрузке (ходьбе, подъеме по лестнице). Отмечает учащение в последнее время приступов таких болей. Более ишемической болезнью сердца в течение 2^x лет. Был поставлен диагноз: ИБС, стенокардия напряжения II-III функционального класса. Была назначена терапия нитратами (сустак-мите 1т х 3 р), кордафеном 1т х 4 р.

У больного из локтевой вены натощак берут 20 мл крови в пробирку, стенки которой предварительно покрыты 1,3 мл смеси гепарина (0,3 мл концентрированного и 1 мл раствора гепарина). Отстаивают кровь в течение 1,5-2 часов при температуре +4,С, после чего кровь расслаивается на верхний плазменный слой богатый тромбоцитами, средний лейкоцитарный слой (пленку) и нижний эритроцитарный. Плазменный слой и лейкоцитарный отсасывают пипеткой и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 минут. В результате центрифугирования образуется супернатант (надосадочная часть), представляющий собой плазму обогащенную тромбоцитами (3) и осадок (центрифугат) состоящий из лейкоцитов с небольшой примесью эритроцитов. Плазму, обогащенную тромбоцитами (ПОТ), переносят в другую пробирку, часть ее отливают и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 30 мин. Супернатантом является плазма бедная тромбоцитами (ПБТ) (3). Лейкоцитарный осадок, полученный при первом центрифугировании, освобождают от эритроцитов посредством осмолизиса. Для этого к осадку последовательно добавляют 3 мл дистиллированной воды с рН 7,35, суспендируют и через 4-5 сек добавляют 1 мл 3,6% раствора с рН 7,35 вновь суспендируют и центрифугируют пр 1000 об/мин 5 минут. Полученный осадок из лейкоцитов при получении примеси эритроцитов вновь подвергают вышеописанному гемолизу. Затем лейкоцитарный осадок взвешивают в 1 мл физиологического раствора с рН 7,35, отмывают подсчитывают в камере Горячева количество лейкоцитов (отдельно гранулоцитов, моноцитов, лимфоцитов); для этого к 0,02 мл лейкоцитарной взвеси добавляют 0,038 мл 3% уксусной кислоты и 1-2 капли 1% раствора метиленовой синьки и прогревают на водяной бане при 95^oC 8-10 мин. После подсчета концентрацию лейкоцитов доводят до 2500 в 1 мкл. Полученная лейкоцитарная взвесь готова к измерению хемилюминесценции (хемилюминесцентных показателей генерации активных форм кислорода лейкоцитами).

Измеряют хемилюминесценцию люминометром LKB Wollac 12051 (Швеция) люминолзависимым хемилюминесцентным методом. Для измерения показателей хемилюминесценции в две кюветы, каждая из которых содержит 0,2 мл лейкоцитарной взвеси, приготовленной ранее добавляют по 0,02 мл рН 7,35 изоосмолярного водного насыщения раствора, затем в одну из кювет добавляют 50-100 мкл плазмы обогащенной тромбоцитами (ПОТ), а в другую 50-100 мкл плазмы бедной тромбоцитами (ПБТ) и проводят измерение хемилюминесценции. Рассчитывается показатель интенсивности хемилюминесценции (ПИХЛ) по формуле:

ПИТ рассчитывается по формуле:

ПИТ у данного больного , что означает, что у данного больного II степень тяжести стенокардии. Таким образом, проводимая терапия не соответствует степенитяжести стенокардии и рекомендовано усилить терапию, а также обязательно включить в нее антиоксиданты.

Пример 2. Больной Д, 56 лет с диагнозом: ИБС, стенокардия напряжения II функционального класса. Поступил с жалобами на приступы редкой боли за грудинкой, возникающие при интенсивной физической нагрузке.

Определяем ПИХЛ под влиянием ПОТ и ПБТ вышеописанным способом. Рассчитываем ПИТ по вышеприведенной формуле: , таким образом у больного невысокая I степень тяжести, таким образом усиления терапии не требуется и включение в терапию антиоксидантов не обязательно (см. таблицу).

Положительный эффект предложенного способа заключается в том, что он позволяет с высокой степенью точности установить степень тяжести стенокардии и назначить адекватную терапию.

Предлагается способ определения степени тяжести стенокардии (с определением двух степеней тяжести) по показателю ингибирующей активности тромбоцитов. Для расчета этого показателя люминолзависимым хемилюминесцентным методом определяют уровень активных форм кислорода, генерируемых лейкоцитами больного в присутствии плазмы обогащенной и бедной тромбоцитами того же больного. По разнице в стимулирующем действии плазмы судят об ингибирующем действии тромбоцитов на генерацию активных форм кислорода лейкоцитами. Рассчитывают показатель ингибирующей активности тромбоцитов (ПИТ) по формуле. Так при значении ПИТ от 29,2% до 40% - I степень тяжести стенокардии, при значении ПИТ меньше 28,2% - II степень тяжести стенокардии. 1 табл.

Способ определения степени тяжести стенокардии, включающий определение в крови больного уровня активных форм кислорода, генерируемых лейкоцитами методом люминолзависимой хемилюминесценции, и расчет по формуле, отличающийся тем, что из крови больного получают лейкоцитарную смесь определенной концентрации и плазму, обогащенную и лишенную тромбоцитов, затем к одной пробе лейкоцитарной взвеси добавляют плазму, обогащенную тромбоцитами, а к другой
лишенную тромбоцитов, определяют в обеих пробах уровень активных форм кислорода, вычисляют показатель ингибирующей активности тромбоцитов (ПИТ) по формуле
где пот плазма, обогащенная тромбоцитами;
пбт плазма, лишенная тромбоцитов;
ПИХЛ показатель интенсивности хемилюминесценции лейкоцитов, вычисляемый по формуле
и при значении ПИТ 28,2 40% определяют I степень тяжести, а ниже 28,2% II степень тяжести стенокардии.