СРЕДСТВО, ПОВЫШАЮЩЕЕ ВЫЖИВАЕМОСТЬ И ОБЛЕГЧАЮЩЕЕ ТЕЧЕНИЕ ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ - ЭКСТРОМЕЛИИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 1995 года по МПК A61K38/04 

Изобретение относится к фармакологии, а именно к лекарственным средствам и может найти применение в медицине и ветеринарии, в частности при лечении вирусных заболеваний.

Известно весьма ограниченное число лекарственных средств, обладающих противовирусной активностью и реально нашедших применение в лечебной практике: ремантадин, оксолин, теброфен, флореналь, риодоксол, бонафтон, метисазон, идоксуридин, гиссипол, интерферон, полудан, дибазол, ацикловир, интерферон (Машковский М. Д. Лекарственные средства. 1984, М. Медицина, т.2, с. 380-387).

На сегодняшний день имеетcя немногочисленное число препаратов пептидной природы, предлагаемые для лечения вирусных заболеваний: пептиды-миметики полибелкового субстрата ретровирусной протеазы, мурамил-пептиды, определенные гликопротеины, пептид из поверхностного антигена гепатита В, низшие пептиды со специфичностью вирусных антигенов, олигопептиды для профилактики и лечения СПИДа, пептид для терапии СПИДа, пептид, содержащий остаток миристилглицина, ингибирующий трансформацию пораженных вирусом клеток, смесь α -интерферона с мурамил-пептидом и ряд других.

Основным недостатком известных противовирусных препаратов является либо:
а) их токсичность: метисазон, кутизон (Машковский М.Д. Лекарственные средства, т.2, 1972, с.416);
б) в основном профилактическое действие: поли-L-гистидин (Патент США N 4863900, 1989), производные α -аминоборсодержащей кислоты (Патент ФРГ N 3827340, 1990), бутилоксианизолы (Заявка Франции, N 2613621, 1988), фактор некроза опухоли в сочетании с интерфероном (Европейская заявка N 0235906, 1987); смесь N-метил-1-адамантанметиламина с 1-морфолинометилтетрагидро-1Н-пиримидинон- ом-2 (Европейская заявка N 0324875, 1989);
в) выработка индивидуальной резистентности в процессе длительного применения препарата азидотимидина (А.М.Сорокин. Иммунология. 1991, N 1, с.71-77);
г) недостаточная эффективность, выражающаяся в больших дозах: алпезарин 0,1г х 3-4 раза в сутки с одновременным применением мази (Авт.св. N 1336301, 1988), ингибитор вируса осповакцины 800-1000 мкг/мл (Авт.св.N 614795, 1978), папаверин в смеси с фармакологическими носителями 50-500 мг/сутки (Заявка Франции N 2618676, 1989), рекомбинантный человеческий α -интерферон 5-75 млн. международных единиц в сутки (Европейская заявка N 0266940, 1988); ремантадин (Машковский М.Д. Лекарственные средства. М. Медицина, т.2, 1984, с.380);
д) аллергенность: флореналь, госсипол (Машковский М.Д. Лекарственные средства. М. Медицина, 1984, т.2, с.382).

е) возможность инфицирования вирусом СПИДа интерферон из плазмы крови.

Действие противовирусного препарата может быть направлено либо непосредственно на репликацию вируса: папаверин в смеси с фармакологическими носителями, пептид, содержащий остаток миристилглицина, ингибирующий трансформацию пораженных вирусом клеток, ингибитор вируса осповакцины, фосфатиды, содержащие полиненасыщенную жирную кислоту в положении 2, 3 -азидо-23 -дезоксиуридиновый препарат, гиперицин и псевдогиперицин, гамма-моногидроксамат L-глутаминовая кислота; либо в большинстве случаев на стимуляцию защитных сил организма хозяина: мурамилпептиды и их производные; производные дипептидил-4-0,6-0-ацил-2-амино-2-дезокси-Д-глюкозы, пентопептиды с иммуностимулирующим действием, трипептид, содержащий Gly, Leu, Phe или Tyr, дипептидилсахариды.

Одними из новых препаратов, применяемых при лечении вирусных инфекций, являются пептиды, выделенные из тимуса: экстракт тимуса эффективен при лечении спида, α-тимозин, фракция 5 полипептида тимозина, полипептид с активностью аналогичной тимозину альфа 1, в том числе и дипептид тимоген, являющийся эффективным иммуностимулятором. Биологический эффект тимогена достигается путем интраназального введения в дозе 1 мкг/кг. В данном исследовании тимоген использовался в качестве препарата сравнения.

На решения задачи повышения эффективности лечения вирусных инфекций, проявляющейся в снижении летальности и облегчении течения заболевания, а также для расширения арсенала пептидных противовирусных средств направлено предлагаемое изобретение.

Задача решается путем применения в качестве препарата, повышающего выживаемость и облегчающего течение вирусной инфекции структурного аналога природного пептидного морфогена гидры со следующей аминокислотной последовательностью Gly-Рro-Рro-Gly-Gly-Ser-Аrg-Val-Ile-Leu-Рhe-OH (Рубина А.Ю. Синтез и исследование пептидного морфогена гидры и его структурных аналогов.

Противовирусное действие вышеназванного пептида изучали на мышах линии NМRI, больных эктромелией (Еctromelia infectiosa), инфекционной болезнью белых мышей, вызываемой ДНК-содержащим вирусом из группы вирусов оспы. Данное вирусное заболевание не поддается лечению и вызывает 80-90% летальность (Эндрюс Х. Вирусы позвоночных. М. 1967; Ветеринарная энциклопедия, М. 1976, т.6, с.590).

Все исследования противовирусного действия пептида проведены на мышах линии NМRI, отбираемых для популяции зараженных мышей при появлении первых признаков заболевания. Внешний осмотр животных проводился три раза в день. Начальная стадия заболевания характеризовалась появлением точечных поражений на коже хвоста и веках глаз. В последствии больные мыши характеризовались отеком и некрозом конечностей и хвоста, изъязвлениями на кончике морды и веках глаз. В 80% случаев болезнь заканчивалась гибелью животных. Мыши содержались в плексиглазовых клетках по 5-6 животных на свободном доступе к пище и воде при комнатной температуре 21±2^оС и 12/12 часовом режиме освещенности. Эффективность лечебного действия препарата сопоставлялась с положительным действием тимогена, используемого в качестве прототипа, и оценивалась 1) по проценту выживаемости больных животных при разных способах введения пептида (подкожно, перорально, и интраназально); 2) по выраженности симптомов болезни у выживших животных, получавших и неполучавших пептид соответственно. Исследования проведены на пике эпизоотии, когда летальность в контрольной группе достигала 90% и на спаде эпизоотии, когда заболевание переходило в хроническую форму и сопровождалось 70% летальностью в контроле к концу месячного срока наблюдения.

П р и м е р 1. Мыши с выраженными признаками болезни распределялись на 4 группы по 10 животных в каждой. 1-я контрольная группа получала ежедневные инъекции физиол. раствора. 2-, 3- и 4-ой группам подкожно в районе лопатки один раз в день вводили раствор пептида в дозах 0,1 и 1 и 20 мкг/кг соответственно на протяжении 12 дней. В каждой группе фиксировали число выживших животных за этот период.

На фиг. 1 представлена динамика изменения численности животных разных экспериментальных группах. Отчетливо проявилась тенденция снижения летальностей в группе животных, получавшей пептид в дозе 0,1 мкг/кг по сравнению с животными других групп. С достоверностью р<0,01 (t_ф=2,98) выживаемость во второй группе была выше по сравнению с 4-ой, получавшей инъекции пептида в дозе 20 мкг/кг.

П р и м е р 2. Экспериментально было показано, что положительное действие пептида на выживаемость животных при вирусной инфекции полностью сохраняется при замене подкожного способа введения пептида пероральным.

Две группы мышей (n=9 и n=13) с выраженными симптомами заболевания находились на свободном рационе питания и неограниченном потреблении воды, при этом в питье экспериментальной группы добавлялся указанный пептид в концентрации 3,3 мкг/л, что приблизительно соответствовало получению пептида в дозе 1 мкг/кг перорально, поскольку экспериментально было установлено, что в среднем в день мышь выпивает 6,1±0,34 мл. Наблюдения за выживаемостью животных этих групп проводились на протяжении двух недель.

На фиг. 2 представлен положительный эффект пептида на выживаемость животных экспериментальной группы. С достоверностью р<0,01 (t_ф=3.2) летальность в экспериментальной группе была ниже, чем в контрольной.

П р и м е р 3. Эксперимент показал, что пероральное применение данного пептида было эффективно и в случае перехода заболевания в хроническую форму, характеризовавшуюся меньшим процентом летального исхода и более медленным развитием заболевания в контрольной группе. В этом случае наблюдения за животными проводились на протяжении месяца.

Мыши с выраженными симптомами вирусного заболевания были разделены на 4 группы по 10 животных в каждой и содержались на свободном рационе питания и питья. I группа пила воду, 2-ая раствор препарата сравнения, тимогена, в концентрации 3,3 мкг/л, 3 и 4-ая группы пили раствор применяемого пептида в концентрации 0,33 и 33 мкг/л соответственно. Как следует из фиг.3, обе дозы данного аналога пептида морфогена гидры в 100% случаев защитили больных животных от гибели, в то время как выживаемость в группе, получавшей тимоген, была в два раза ниже. В контрольной группе к моменту окончания эксперимента погибло 70% животных.

П р и м е р 4. Дополнительно было обнаружено, что исследуемый пептид проявляет свойство снижать летальность животных при вирусной инфекции и в случае интраназального введения, при этом доза вводимого пептида уменьшается в 10 раз по сравнению с пероральным введением и составляет 0,1 мкг/кг.

Мыши с выраженными симптомами заболевания содержались на свободном рационе питания и питья. Экспериментальной группе (n=9) ежедневно вводился указанный пептид в дозе 0,1 мкг/кг в объеме 10 мкл в каждую ноздрю животного на протяжении месяца. Контрольным животным (n=11) интраназально вводили дистиллированную воду, а группе активного контроля (n=10)-тимоген в дозе 1 мкг/кг. Из фиг.4 видно, что интраназальное введение столь малой дозы пептида оказывало выраженное защитное действие от гибели животного. При этом защитный эффект указанного пептида был значительно выше, чем у тимогена, и по интенсивности защитного действия не уступал защитному эффекту данного пептида при пероральном введении (сравнить с фиг.3).

Таким образом применение пептида указанной структуры оказалось эффективным для предотвращения гибели животных как при острой, так и при хронической форме течения тяжелого вирусного заболевания, при этом защитное действие проявилось при подкожном (п/к), пероральном (р/о) и интраназальном (и/н) введениях.

На фиг. 5 представлены данные по выживаемости больных мышей при разных способах введения изученного пептида по сравнению с нелеченными животными.

Экспериментально было установлено, что заявляемый пептид не только эффективно снижает процент гибели животных, но и облегчает течение заболевания у выживших животных. В таблице приведена оценка выраженности симптомов болезни у животных, прошедших курс лечения синтетическим пептидом при разных дозах и способах его введения по сравнению с контрольной группой и группой, получавшей тимоген интраназально.

Из представленных в таблице данных следует, что наиболее эффективными лечебными дозами указанного пептида являются 1 мкг/кг при пероральном введении и 0,1 мкг/кг при интраназальном введении. При их использовании снижается выраженность кожных поражений и увеличивается процент животных без внешних признаков данного заболевания.

Отрицательных побочных эффектов у изученного пептида на поведение в действующих дозах 0,1 мкг/кг в тестах "открытое поле" не обнаружено. Не отмечено изменений в способности обучения и памяти в пассивнооборонительном и активнообо- ронительном навыках у животных на фоне и в последействии данного пептида. Обнаружен слабый активирующий эффект пептидного препарата, проявившийся в антидепрессивном действии (тесте Порсольта) и в анксиолитическом эффекте (тесте приподнятого крестообразного лабиринта).

Пептид с указанной структурой может найти применение в качестве лекарственного препарата при лечении вирусных заболеваний.

Изобретение относится к фармакологии, а именно к разработке лекарственных средств, и может найти применение в медицине и ветеринарии. Синтетический аналог природного морфогена гидры, имеющий аминокислотную последовательность Gly-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-Arg-Val-Jle-Leu-Phe-OH предлагается в качестве противовирусного средства, решается задача снижения летальности с 80 до 20% и облегчения течения вирусного заболевания экстромелии эксперименте. Вышеназванный пептид в дальнейшем может использоваться в качестве лекарственного препарата. Рабочие доза (0,1 1 мкг/кг) не оказывают побочного отрицательного действия. 5 ил. 1 табл.

Применение структурного аналога пиродного пептидного морфогена гидры со следующей аминокислотной последовательностью:
Gly Pro Pro Gly Gly Ser Arg Val Ile Leu Phe OH
в качестве средства, повышающего выживаемость и облегчающее течение вирусной инфекции экстромелии в эксперименте.