СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДАПТАЦИОННЫХ ВОЗМОЖНОСТЕЙ ОРГАНИЗМА Российский патент 1995 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к биологии, медицине и ветеринарии, а более конкретно к способам оценки состояния неспецифической резистентности организма по данным цитологического исследования периферической крови.

Известны способы оценки естественного иммунитета по фагоцитозу и метаболическим параметрам гранулоцитов (в основном, нефтрофилов, в меньшей степени, эозинофилов и базофилов) с использованием цитохимических маркеров клеток периферической крови: реакция по Пигаревскому на неферментный катионный белок, лизосомный маркер-кислую фосфатазу, НСТ-тест.

Наиболее распространены способы оценки фагоцитарной активности нейтрофилов с использованием микробных тест-культур. Представляет интерес способ избирательного усиления фагоцитоза в отношении определенного микробного антигена.

Доказано, что выявление интралейкоцитарнго лизоцима в определенной степени отражает состояние естественной защиты организма.

Критерием активации фагоцитов считают метаболические перестройки, связанные с накоплением бактерицидных веществ. Что касается полинуклеаров, то бактерицидные эффекты в них в значительной мере коррелируют с генерацией перекиси водорода, избыток которой разрушает эндогенная миелопероксидаза. Содержание пероксидазы легко определяется при помощи специальной реакции с использованием бензидина. Замечено, что при нарушении фагоцитарной функции нейтрофилов, нормализация фагоцитарной активности, как правило, сопровождается активацией пероксидазы. По нашим наблюдениям, происходит это не столько в связи с интенсификацией синтеза эндогенной пероксидазы, сколько в результате заимствования зрелыми нейтрофилами пероксидазной системы извне. Установлено, что эозинофилы выделяют экстрацеллюлярно пероксисомные ферменты и большинство авторов связывают наличие паракристаллической сердцевины в специальных гранулах с пероксидазой в критических величинах. Известно также, что миелопероксидаза состоит из субъединиц с молекулярным весом 57 000, 39 000 и 15 500, а эозинофилпероксидаза с м.в. 50 000 и 15 500. Логично предположить, что нейтрофил-реципиент получается от эозинофила-донора пероксидазу в виде субъединиц с м.в. 15500, которую он способен включить в свой метаболизм. Во всяком случае, кристаллоидные структуры, появляющиеся в азурофильных (первичных) гранулах нейтрофилов, мельче, чем у эозинофилов, но крупнее собственной амфофильной зернистости и к тому же резкопероксидазоположительны как истинные эозинофильные гранулы. Для большей убедительности в своих примерах мы приводим иллюстративный материал, демонстрирующий процесс трансгрануляции в костном мозге на ультраструктурном уровне и оригинальные рисунки, выполненные при наблюдении клеток периферической крови в световом микроскопе.

До тех пор, пока нейтрофилы сохраняют способность заимствовать пероксидазу у эозинофилов, в организме происходят компенсаторно-приспособительные реакции, ведущие к восстановлению гомеостаза, поскольку пероксидазная система принимает участие в обеспечении бактерицидных и цитотоксических свойств клеток. Таким образом, это явление можно считать положительным прогностическим признаком в оценке адаптацинного синдрома гранулоцитов. Следует отметить, что речь идет о субпопуляции нейтрофилов с оксифильной реакцией части гранул, псевдоэозинофилов или точнее, гетерофилах.

Известно, что постоянно в норме псевдоэозинофилы есть, например, у кроликов до 30% у морских свинок 32% однако к гетерофилам можно отнести, по-видимому, клетки, содержащие и другую смешанную зернистость: базофильную и эозинофильную, поэтому на последнем названии и остановимся. По данным базофилы могут тоже заимствовать пероксидазу эозинофилов.

Все известные способы регистрации естественной сопротивляемости организма представляют безусловный интерес, но громоздки в исполнении, требуют специального оборудования и реактивов. Кроме того, они свидетельствуют о реактивности, но не позволяют судить о степени резистентности и глубине адаптационного процесса на клеточном уровне. Все это затрудняет их широкое применение в практике медицины и ветеринации.

Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, является способ определения лизоцима (ЛЦ) в лейкоцитах при котором мазки крови, высушенные на воздухе, фиксируют спиртово-формалиновым раствором, расчерчивают на две части, одну инкубируют с гистамином во влажной камере, ополаскивают, высушивают, окрашивают и осуществляют учет клеток, затем по разнице полуколичественного учета гранул на двух частях мазка рассчитывают активность интралейкоцитарного ЛЦ.

Недостатком указанного способа является то, что этот параметр (пЛЦ) инертный показатель, т.е. он "работает" при ярко выраженной клинике и, следовательно, в доклинический период не эффективен. Кроме того, он является достаточным по сравнению с сывороточным лизоцимом в характеристике естественной сопротивляемости, но не отражает глубины происходящих процессов и уровня компенсаторных реакций.

Целью изобретения является повышение информативности и точности способа за счет осуществления регистрации трансгрануляции и ее масштабов в межклеточных взаимоотношениях.

Настоящая цель достигается тем, что в известном способе, включающем приготовление мазков крови и учет клеток, новым является то, что перед учетом клеток осуществляют поиск нейтрофилов с оксифильной реакцией гранул, эозинофилов с частичной дегрануляцией и клеток со смешанной эозино-базофильной зернистостью, при наличии последних, а затем подсчитывают индекс гетерофилов (нефтрофильно-эозинофильных), по которому оценивают полноценность компенсаторно-приспособительных реакций организма. В лейкограмме при появлении гетерофилов регистрируется эозинофилия.

Сопоставительный анализ с прототипом показывает, что предлагаемый способ характеризуется наличием новых действий: поиск нейтрофилов с оксифильной реакцией гранул, эозинофилов с частичной дегрануляцией и подсчет индекса гетерофилов на 100-200 нейтрофилов, по которому оценивают полноценность компенсаторно-приспособительных реакций организма. Таким образом, предлагаемый способ соответствует критерию изобретения "новизна".

Признаки, отличающие предлагаемый способ от прототипа, не выявлены в других технических решениях при изучении данной и смежной областей медицины и ветеринарии и, следовательно, обеспечивает предлагаемому решению соответствие критерию "существенные отличия".

Способ реализуется следующим образом. Мазки периферической крови окрашивают по Май-Грюнвальду или по Паппенгейму. Использование одного красителя Романовского-Гимзы не рекомендуется, так как в случае не столь очевидны различия в окраске оксифильных и амфофильных гранул нейтрофилов. Краска Май-Грюнвальда является специфической для нейтрофильных гранул + краска Романовского-Гимзы усиливают оксифильный оттенок во всех клетках. Это и есть паноптическая окраска по Паппенгейму. Ведется одновременный поиск эозинофилов с частичной дегрануляцией и гетерофилов. Дополнительным подтверждением в случае необходимости может быть реакция на пероксидазу. Следует при этом иметь в виду, что облучение является ингибитором эндогенной миепероксидазы, но не эозинофилпероксдазы.

Таким образом, в отличие от известного способа учитываются морфологические особенности гранулоцитов и по сочетанию признаков среди всех них оценивают адаптационный синдром в системе неспецифической резистентности (клеточное звено).

На мазке крови подсчитывают на 100-200 нейтрофилов индекс (%) гетерофилов, т.е. нейтрофилов с оксифильной реакцией части гранул, используя иммерсионную систему биологического микроскопа. Наблюдения ведут на стадии первичной декомпенсации (1-3 сут). В динамике показательны данные на 5-6 сут, 14 и 30 сут, когда происходит стабилизация основных показателей и наступает полное выздоровление. О проявлении адаптационного синдрома судят по индексу гетерофилов в периферической крови
ИГ , где ИГ индекс гетерофилов, Г количество нейтрофилов с оксифильной реакцией, 100 всего подсчитано нейтрофилов.

П р и м е р 1. Крыс линии Вистар обоего пола (33 гол.) весом 160-180 г облучали на гамма-установках (источник 137 Cs), в диапазоне доз от 0,3 до 6 Гр. Контролем служили 7 интактных крыс. Наблюдения проводили на мазках периферической крови, окрашенных по Паппенгейму в 1-е, 3 и 5 сут после воздействия, так как первичная декомпенсация при облучении наступает уже в первые сутки, а между 3-5 сут исчезает (при малых дозах), показатели приближаются к норме даже при более высоких дозах, если сохраняются полноценными компенсаторные реакции организма. На каждом мазке подсчитывали 100-200 нейтрофилов, вычисляя процент гетерофилов среди них. Как выяснилось, в крови крыс и в норме наблюдаются гетерофилы около 10% Не замечать их могут по той простой причине, что у крыс-лимфоцитарный профиль крови, при подсчете же лейкограммы учитывается до 25% нейтрофилов, среди которых, если и попадаются 2-3 гетерофила, их причисляют к эозинофилам (особенно на фоне эозинофилии), либо считают артефактами окраски.

При дозе 0,3 Гр в первые сутки после воздействия наблюдается нарастание содержания гетерофилов в периферической крови (табл. 1), при повышении дозы до 2 Гр первоначальное ингибирование; в обоих случаях к 5 сут происходит нормализация показателей. При малой дозе в костном мозге регистрируются митотические фигуры среди эозинофилов, что коррелирует с увеличением содержания их в периферической крови (2,25± 0,48 против 0,57± 0,09 в контроле в 1-е сутки 5,00± 1,63 на 3 сут и снова 2,50± 0,50 на 5 сут.).

При дозе 6 Гр (сублетальная доза) ингибирование до уровня 1,8% гетерофилов в крови свидетельствует о невозможности восстановления защитных реакций-костный мозг опустошается и животные гибнут.

Параллельное исследование ультраструктуры костного мозга подопытных животных позволило установить что при нарастании содержания гетерофилов в крови в костном мозге регистрируется в больших масштабах заимствование у эозинофилов пероксидазной системы (гранул с кристаллоидами) и не только нейтрофилами, но и эндотеолиоцитами синусоидных капилляров, а также тромбоцитами, что может свидетельствовать о вовлечении этих структур в фагоцитоз. Для большей убедительности и наглядности приводим несколько электронных микрофотографий, полученных с помощью электронного микроскопа "Тесла БС-500" при ускоряющем напряжении 75 кВ.

Адаптационный синдром в популяции гранулоцитов по установленным качествам можно расценивать как положительный прогностический признак постепенного восстановления гомеостаза в рамках системы неспецифической защиты, т.е. клеточного звена естественного иммунитета.

П р и м е р 2. Исследована кровь 3-х "ликвидаторов" 1986 г. (жители Днепропетровска) до набора в течение 2-х недель дозы 0,25 Гр в 30 км зоне ЧАЭС, затем сразу после выхода из зоны, через 2 недели и спустя месяц (табл. 2).

Человек имеет нейтрофильный профиль крови в отличие от крысы (в среднем около 60% нейтрофилов в лейкограмме). У ликвидаторов" из г. Днепропетровска гетерофилы оказались в норме, примерно 2 на 60 нейтрофилов. Лейкограммы во все сроки наблюдения были у них в пределах физиологической нормы с небольшими индивидуальными различиями. Определение гетерофилов демонстрирует информативность способа. Как видно из табл. 2, первичная декомпенсация не исчезает через 2 недели нормализация показателя наступает через месяц. Тем не менее, можно считать компенсаторно-приспособителную реакцию полноценной. Процесс "растянут" во времени, по-видимому, в связи с тем, что доза набиралась постепенно в течение 2-х недель. Закономерность стимуляции образования гетерофилов (заимствования нейтрофилами пероксидазной системы) подтверждается как положительный прогностический признак. В крови людей регистрируются эозинофилы (повышенное содержание) с частичной дегрануляцией. Наличие таких клеток является своеобразным сигналом для подсчета гетерофилов.

П р и м е р 3. Сравнение показателей, отражающих состояние естественной защиты по известному (пЛЦ) и предлагаемому (ИГ) способам (табл. 3).

Очевидно, что ИГ надежнее в прогнозе исхода изменений в организме.

Применение предлагаемого способа может быть весьма полезным в медицине и ветеринарии. Особенно чувствителен способ при облучении, хотя и не является сугубо специфическим при подобном воздействии. Способ предельно прост и легко выполним в полевых условиях. Для его реализации требуется 1-2 мазка крови, на которых после окраски по Май-Грюнвальду или Паппенгейму подсчитывают количество гетерофилов на 100 нейтрофилов. Способ позволяет оценить состояние основного клеточного звена в системе естественного иммунитета (неспецифической резистентности) и прогнозировать течение болезни эффективность лечения и др. Способ позволяет оценить глубину компенсаторно-приспособительных реакций костного мозга, используя только мазки периферической крови.

Таким образом, предлагаемый способ является высокочувствительным, достаточно информативным и легко выполним в лабораторных и полевых условиях при наличии микроскопа с иммерсионной системой.

Использование: в биологии, медицине и ветеринарии, может применятся для оценки состояния неспецифической резистентности организма по данным цитологического исследования периферической крови. Сущность изобретения: готовят мазки крови, осуществляют поиск нейтрофилов с оксифильной реакцией гранул, эозинофилов с частичной дегрануляцией, затем подсчитывают индекс гетерофилов на 100 200 нейтрофилов, по которому оценивают полноценность компенсаторно-приспособительных реакций организма. Способ позволяет повысить информативность и точность способа за счет осуществления регистрации трансгрануляции и ее масштабов в межклеточных взаимоотношениях. 3 табл.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДАПТАЦИОННЫХ ВОЗМОЖНОСТЕЙ ОРГАНИЗМА, включающий приготовление мазка крови с последующим учетом на нем клеток, отличающийся тем, что перед учетом клеток осуществляют поиск эозинофилов с частичной дегрануляцией и клеток со смешанной базофильно-эозинофильной зернистостью и при наличии этих клеток проводят подсчет нейтрофилов с оксифильной реакцией части гранул и определяют индекс гетерофилов (ИГ) по формуле ИГ Г/100, где Г количество гетерофилов нейтрофильного профиля, 100 количество всех нейтрофилов, и при его значении 2-10 определяют развитие компенсаторно-приспособительных реакций организма, при более 10 напряжение механизмов естественной защиты как в пределах физиологической нормы, а при значении менее 2 смещение приспособительных реакций в область патологии.