СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЫЧУЖНОГО ФЕРМЕНТА Российский патент 1995 года по МПК C12N9/64 

Изобретение относится к способам получения сычужного фермента из сычугов телят и ягнят-молочников и может быть использовано при производстве молокосвертывающих препаратов для сыроделия в молочной промышленности, а также в медицине.

Известен способ получения сычужного порошка из сычугов телят и ягнят [1] предусматривающий проведение трехкратной эстракции фермента 10%-ным раствором хлористого натрия измельченных высушенных сычугов телят, ягнят при температуре от 2 до 4^оС в течение 60-72^оС. Экстракт сливают, фильтруют через нутч-фильтр, добавляют соляную кислоту до рН 1,5-2,0 и при внесении соли до концентрации 20% высаливают фермент. После отстаивания в течение 20-24 ч, высол собирают, отпрессовывают излишнюю влагу и сушат в калориферной или сублимациронной сушилке. Высушенный фермент измельчают, просеивают, нормализуют и смешивают с наполнителем (хлористым натрием).

Недостатком известного способа является: длительная экстракция фермента в течение 60-72 ч, что может привести к нежелательному развитию психрофильной микрофлоры, а процесс высаливания является трудоемким и нестабильным, зависит от параметров проведения процесса (температура, рН, концентрация хлористого натрия и др.) и сопровождается потерей фермента. Наблюдаются потери и при сушке ферментного высола. Следует также отметить, что после высаливания остается маточный раствор, который представляет собой сильнокислый 20%-ный раствор хлористого натрия. Этот раствор в дальнейшем не используется и сливается в канализационные стоки, что экологически небезопасно. Для достижения уровня ПДК по иону хлора необходимый фактор разбавления составляет 125. При высаливании сычужного фермента отмечается не только переход его в нерастворимое состояние, но и активирование (превращение пепсиногена в пепсин, прореннина в реннин), сопровождающееся частичной потерей активности пепсина и реннина, так как изоточки этих составляющих сычужный фермент компонентов различаются (изоточка пепсина при рН 1,0, а реннина 4,6), а высаливание идет при рН 1,5-2,0.

Технической задачей изобретения является повышение выхода фермента и улучшение его качества.

Для этого в предлагаемом способе предусматривается экстракция сычужного фермента из сырья [измельченных высушенных или законсервированных другим способом сычугов телят и ягнят-молочников (охлажденных, замороженных и т.д. )] 5-12%-ным раствором хлористого натрия с добавлением консерванта 0,1-3,0% бензоата натрия в течение 4-12 ч с перемешиванием в течение первых 10-30 мин каждый час, затем снижают рН от 4,0 до 5,8 добавлением соляной кислоты, перемешивают и продолжают экстракцию в течение 12-20 ч при 1-8^оС. Соотношение сырья и жидкости от 1:6 до 1:30. Экстракцию повторяют трижды, после каждой экстракции жидкую часть сливают, фильтруют, сепарируют, концентрируют ультрафильтрацией, концентрат очищают фильтрацией и жидким расфасовывают или сушат.

Сопоставительный анализ предлагаемого способа с прототипом показывает, что предлагаемый способ отличается от известного тем, что экстракцию проводят в благоприятной для стабильности сычужного фермента, состоящего из двух составляющих (реннина и пепсина) зоне рН 4,0-5,8. В этой зоне рН происходит активирование фермента в течение процесса экстракции (превращение предшественников этих ферментов прореннина и пепсиногена в реннин и пепсин), что позволяет сразу после очистки концентрировать его ультрафильтрацией.

Другое отличие состоит в том, что процесс ведут в присутствии консерванта (0,1-3,0% бензоата натрия), подавляющего рост психрофильной микрофлоры, а экстракт, очищенный от большей части бактерий и балластных веществ, концентрируют ультрафильтрацией, ультрафильтрат используют повторно в качестве экстрагирующего раствора, а концентрат после повторной фильтрации расфасовывают в тару в жидком виде или сушат.

Данная совокупность признаков позволяет повысить выход сычужного фермента на 10-20% улучшить качество фермента (снизить количество нерастворимого остатка и жира, уменьшить бактериальную обсемененность продукта).

П р и м е р 1. Охлажденные или дефростированные после замораживания сычуги телят или ягнят-молочников массой 10 кг измельчают на волчке с диаметром решетки 5 мм.

Полученное сырье заливают 60 л 10%-ного хлористого натрия (1:6) добавляют 900-1000 г (1,5%) бензоата натрия, перемешивают в течение первых 10 мин каждого часа в течение 6 ч, затем при перемешивании добавляют концентрированную соляную кислоту (плотность 1,19), снижая рН до 5,0-5,5, продолжают экстракцию без перемешивания в течение 18 ч при температуре экстрагента -4^оС.

После этого экстракт сливают, с остатками сырья повторяют аналогичную процедуру дважды, причем третью экстракцию проводят при уменьшении количества экстрагирующего раствора в два раза (30 л 10%-ного хлористого натрия).

Жидкую прозрачную часть экстрактов сливают сифонированием, очищают от взвешенных частиц сепарированием при 5-10 тыс. об/мин, затем экстракт фильтруют через специальные фильтрующие материалы, подают на фильтр-пресс и фильтруют через картон марки КО или фильтрующие пластины марки Ф-1, КФО и др.

Очищенный экстракт подают питающим насосом в ультрафильтрационную установку (плоскорамный мембранный модуль с использованием полисульфоновых мембран на лавсановой и полипропиленовой подложках с диаметром пор 200-300 ангстрем или разделительных аппаратах на полых волокнах типа АР-2,0 и др.) и концентрируется в 30-200 раз. После того как весь экстракт подан в установку ультрафильтратом вытесняют концентрат в последний контур. Полученный концентрат нормализуют до заданной активности, добавляют консервант, подают на фильтр-пресс и фильтруют через фильтрующие пластины марок "Ф-1", "КФО", "СФ-1" и др, расфасовывают в жидком виде в бутылочки емкостью 450-500 мл, укупоривают пробками и металлическими колпачками.

Для проведения сублимационной сушки в концентрат добавляют не более 25% хлористого натрия к объему, разливают слоем 6-15 мм на противни, замораживают до температуры замороженного слоя от -40 до -25^оС и сухого слоя не выше 40^оС до достижения в разных точках продукта температуры от 30 до 35^оС. Сухой концентрат измельчают в шаровой мельнице и просеивают через сито.

Нормализацию (доведение до стандартной активности) жидкого сычужного фермента проводят добавлением концентрата, а сухого смешиванием с наполнителем сухой, измельченной, просеянной солью в смесителе.

Собранный в процессе ультрафильтрации в емкости с водяной рубашкой (температура воды 4-20^оС) фильтрат используют повторно. С этой целью для второй экстракции к сычугам добавляют фильтрат (около 36 л), а недостающую часть (14 л) восполняют 12% NaCl с добавлением 1,5% консерванта, при третьей экстракции эти объемы в два раза меньше. Расход сычугов на 1 л жидкого сычужного фермента (активность по свертыванию молока 100 тыс.усл.ед.) составил 16 шт.

П р и м е р 2. Сухие сычуги телят в количестве 10 шт (400 г) измельчают на плоскости шириной 8 мм, заливают 12 л 12%-ного раствора хлористого натрия (1:6) (рН раствора 6,3), добавляют 180 г бензоата натрия (1,5%), перемешивают в течение первых 12 ч, добавляют концентрированную соляную кислоту (плотность 1,19) до рН 4,0, затем отстаивают в течение 10-12 ч, процесс проводят при температуре 20^оС. Прозрачный экстракт сифонируют и аналогичную процедуру повторяют дважды. Далее процесс проводится как в примере 1. Увеличение концентрации хлористого натрия более 12% не приводит к увеличению эффективности экстракции.

Расход сычугов на 1 л жидкого сычужного фермента (активность по свертыванию молока 100 тыс.усл.ед.) 19 высушенных сычугов.

П р и м е р 3. Охлажденные сычуги телят молочников измельчают на волчке (масса сырья 5,0 кг). Полученное сырье заливают 30 л 8%-ного хлористого натрия (1:6), добавляют 0,1% бензоата натрия (300 г), перемешивают в течение 20 мин каждого часа в течение 4 ч, затем снижают рН добавлением концентрированной соляной кислоты до рН 5,0, отстаивают в течение 20 ч. При добавлении консерванта в количестве менее 0,1% отмечен рост микрофлоры при экстракции при температуре от 4 до 20^оС. Далее полученный экстракт обрабатывают как в примере 1.

Расход охлажденных сычугов телят на 1 л жидкого сычужного фермента (100 тыс. активность) составляет 18 шт на 1 кг сухого (100 тыс. уcл.ед.) 18,5 шт.

П р и м е р 4. Замороженные и измельченные сычуги телят измельчают на волчке (1 кг). Полученное сырье заливают 6 л 6%-ного хлористого натрия (1:6) и добавляют (600 г) 3%-ного бензоата натрия и далее обработку экстракта проводят как в примере 3. Добавление консерванта в количестве более 3% экономически невыгодно.

Расход замороженных сычугов телят на 1 л жидкого сычужного фермента (акт. 100 ТУЕ) составляет 16 шт, на 1 кг сухого 16,5 шт.

П р и м е р 5. Замороженные и охлажденные сычуги телят измельчают на волчке (1 кг). Полученное сырье заливают 10 л 8%-ного хлористого натрия (1: 10) и добавляют 3у% бензоата натрия, перемешивают в течение первых 30 мин каждого часа в течение 12 ч, затем снижают рН до 5,8 и отстаивают в течение 12 ч. Экстракцию проводят при 6^оС, процедуру повторяют дважды. Далее экстракт обрабатывают как в примере 1.

Расход замороженнрх сычугов телят на 1 л жидкого сычужного фермента (100 ТУЕ) составляет 16 шт. на 1 кг сухого 20 шт.

П р и м е р 6. Получение сычужного фермента проводят в соответствии с примером 1, но без перемешивания при проведении экстракции 12%-ным хлористым натрием.

Отмечено резкое ухудшение процесса экстракции и расход сычугов составил 30 шт. на 1 л жидкого сычужного фермента (активность 100 ТУЕ).

П р и м е р 7. Получение сычужного фермента проводят в соответствии с примером 1, но экстракцию проводят четыре раза, причем четвертую экстракцию проводят как третью (30 л 10%-ного хлористого натрия).

Установлено, что проведение четвертой экстракции не оказывает существенного влияния на выход продукции. Расход сычугов на 1 л жидкого фермента составил 16 шт.

Технические характеристики сычужного фермента, полученного по предлагаемому и известному способам, приведены в таблице.

Предлагаемый способ получения сычужного фермента позволяет улучшить качество готовой продукции за счет снижения количества нерастворимого остатка до 0,2-0,5% в готовом продукте и повысить выход на 5-25% по сравнению с традиционным.

Анализ результатов опытов по примерам 1-5 показывает, что на увеличение эффективности экстракции влияет снижение рН до 4-5,8, в результате чего, с одной стороны, происходит частичная денатурация балластных веществ, экстрагируемых из сычугов, с другой активируются нативные ферменты тканей сычугов (катепсина и др. тканевые протеиназы), при этом создаются условия для перехода предшественников компонентов сычужного препарата (пепсиногена и реннина) из тканей в раствор. При экстракции сычугов с перемешиванием менее 4 ч эффективность экстракции снижается, а увеличение выдержки более 12 ч не приводит к существенному увеличению количества проферментов в экстракте.

Снижение рН экстракции до 4-5,8 позволяет не только проводить процесс дальнейшей экстракции в зоне стабильности фермента, но также создает условия для постепенного превращения проферментов (прореннина и пепсиногена) в активные ферменты (реннин и пепсин).Особенно это положение относится к реннину, так как его содержание составляет 60-90% в сычужном ферменте.

При снижении рН менее 4,0 образующийся из прореннина реннин попадает в нестабильную зону и активность частично теряется, при рН более 5,8 не происходит превращение проферментов в их активные формы.

При соотношении сырья и экстрагирующей жидкости 1:(6-30) снижаются потери фермента. При соотношении сырья и жидкости менее 1:6 потери могут составить 10-15% а при соотношении более 1:3, значительно возрастают потери при дальнейшей обработке сырья при сепарировании, фильтрации, ультрафильтрации за счет продолжительной обработки больших объемов экстракта. Кроме того, при соотношении сырья и жидкости менее 1:6 замедляется процесс разделения фаз, а при уменьшении 1:30 увеличивается продолжительность разделения.

Добавление консерванта (бензоата натрия) в количестве от 0,1 до 3% к объему экстракта позволяет проводить процесс при температуре от 4 до 20^оС. При концентрации бензоата натрия менее 0,1% отмечено увеличение нежелательного роста бактерий в экстракте, а увеличение концентрации консерванта более 3% не приводит к существенному подавлению роста микрофлоры и экономически невыгодно.

С целью улучшения качества фермента и увеличения выхода после отделения экстракта от остатков сычугов его очищают сепарированием и фильтрованием, концентрируют дополнительно очищают ультрафильтрацией, очищенный концентрат используют в жидком виде или сушат в сублимационной сушилке.

Предлагаемый способ позволяет снизить в 2 раза расход поваренной соли и в 5-10 раз расход кислоты, решает вопросы охраны окружающей среды, так как фильтрат, получаемый на стадии ультрафильтрации, повторно используется в качестве экстрагирующей жидкости.

Способ получения сычужного фермента из сычугов телят и ягнят проверен в экспериментальных условиях НПО "Комплекс".

Использование: биотехнология, сыроделие и в медицинских целях. Сущность изобретения: способ получения сычужного фермента предусматривает измельчение сычугов телят и ягнят-молочников, трехкратную экстракцию фермента раствором хлористого натрия, отделение жидкой фазы, фильтрование раствора, концентрирование фермента, фильтрование концентрата или сушку. В качестве сырья используют консервированные сычуги телят и ягнят-молочников, которые обрабатывают 5 12%-ным раствором хлористого натрия с добавлением 0,1 3 бензоата натрия, перемешивая его 10 30 мин каждого часа в течение 4 12 ч, а затем снижают pH раствора до 4,0 5,8, экстрагируют фермент в течение 12 24 ч при 4 20°С, при этом соотношение сырья и раствора составляет 1 (6 30), экстракцию повторяют трижды, причем третью экстракцию проводят при соотношении сырья и раствора 1 (3 15), после фильтрования концентрируют ультрафильтрацией, затем концентрат фильтруют и жидким расфасовывают или сушат. Ультрафильтрат повторно используют в качестве экстрагирующей жидкости при соответствующей коррекции pH и процентного содержания консерванта. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЫЧУЖНОГО ФЕРМЕНТА, предусматривающий измельчение сычугов телят и ягнят-молочников, трехкратную экстракцию фермента раствором хлористого натрия, отделение жидкой фазы, фильтрование раствора, концентрирование фермента, отличающийся тем, что в качестве сырья используют консервированные сычуги телят и ягнят-молочников, которые обрабатывают 5-12%-ным раствором хлористого натрия с добавлением 0,1-3% бензоата натрия, перемешивая смесь 10-30 мин каждого часа в течение 4-12 ч, а затем снижают рН раствора до 4,0-5,8, экстрагируют фермент в течение 12-24 ч при 4-20^oС, при этом соотношение сырья и раствора составляет 1:6-30, экстракцию повторяют трижды, причем третью экстракцию проводят при соотношении сырья и раствора 1:3-15, после фильтрования раствор концентрируют ультрафильтрацией, затем концентрат фильтруют и жидким расфасовывают или сушат. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что ультрафильтрат повторно используют в качестве экстрагирующей жидкости при соответствующей коррекции рН и процентного содержания консерванта.