СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ Российский патент 1995 года по МПК C12N11/02 

Изобретение относится к химии высокомолекулярных биологически активных соединений и может найти применение в биохимической практике для получения стабильного переносчика кислорода, обладающего одновременно пролонгированной антиоксидантной активностью.

Известен способ получения ковалентно иммобилизованной супероксид дисмутазы (супероксид: супероксид оксидоредуктаза) (СОД) на полиэтиленгликоле (ПЭГ). Он реализован с помощью совокупности следующих существенных признаков.

Цианурат хлоридом в органическом растворителе активировали ПЭГ-5000. К активированному ПЭГ добавляли СОД и вели реакцию при перемешивании при комнатной температуре. Целевой продукт выделяли хроматографией.

Основным недостатком известного способа является невозможность биодеструкции полученного полимерного производного СОД в организме. Кроме того, целевой продукт не обладает способностью к переносу кислорода.

Целью изобретения является придание иммобилизированной СОД способности к биодеструкции и газотранспортной функции.

Цель достигается способом получения иммобилизованной СОД, который реализуется следующей совокупностью существенных признаков.

К водному 0,4-1%-ному (маc.) раствору СОД с рН 6,8-7,4 добавляют 1-2%-ный (мас. ) водный раствор глутарового альдегида (ГА) при 5-15^оС. Молярное отношение CОД: ГА 1:(95,4-228). В реакционную смесь при перемешивании добавляют 0,68-5%-ный (мас.) водный раствор гемоглобина (Гб). Соотношение СОД Гб 1:(1-13,4). Реакцию завершают введением реагента, блокирующего свободные альдегидные и непредельные группировки, возникающие в ходе реакции в иммобилизованной СОД. Целевой продукт выделяют хроматографией.

Целевой продукт характеризовали величиной ММ 32000 количеством присоединяющейся СОД, контролировали отсутствие в нем примеси СОД, не связанной ковалентно, определяли активность иммобилизованной СОД и оценивали газотранспортную функцию.

Анализ известного уровня науки и техники показал, что заявленный способ получения иммобилизованной СОД не известен.

В качестве иллюстрации заявленного способа приведены фиг.1 и 2 (по примеру 1). Для остальных примеров фигуры в значительной мере аналогичны.

На фиг. 1 представлена хроматограмма продуктов реакции, полученная на колонке (1,8 х 60 см) с сефарозой 6 В. По оси ординат оптическая плотность, по оси абсцисс объем элюции.

На фиг 2 представлены кривые диссоциации кислорода для полимерного Гб (ПГб), получаемого взаимодейcтвием Гб, выделяемого из эритроцитов, c бифункциональным cшивающим агентом в водных раcтворах, cуперокcид диcмутазы (cуперокcид: cуперокcид окcидоредуктаза) с иммобилизованной СОД (кривая 1) и ПГб той же ММ (кривая 2). По оси ординат насыщение Гб-звеньев кислородом (в) по оси абсцисс Р_О2 парциальное давление кислорода (в мм рт.ст.).

Хорошо видно, что для кривых 1 и 2 Р₅₀ величины парциального давления кислорода при полунасыщении полимерных производных кислородом практически равны 24 и 25 соответственно. При этом параметр, характеризующий кооперативность процесса присоединения кислорода к ПГб для сравниваемых полимерных продуктов также идентичен и равен 1,3.

Активность СОД определяли спектрофотометрически при λ 560 нм по калиброванию восстановления красителя нитротетразолиевого синего в системе репарации супероксидных радикалов рибофлавин-метионин.

Концентрация гемоглобина определялась спектрофотометрически при λ= 540 нм с помощью цианметгемоглобинового производного, среднемассовую ММ определяли исходя из ММР на сефарозе 6В с использованием стандартных калибровочных белков в интервале ММ от 14 ˙10³ до 900 ˙10³.

П р и м е р 1. К 1,48 мл 0,5%-ного (мас.) водного (0,15 М хлористый натрий) раствора СОД медленно прибавляют 0,25 мл 1,9%-ного (мас.) водного раствора ГА. Реакционную смесь перемешивают 60 мин при 10^оС и добавляют 4 мл 5% -ного (мас. ) водного (0,15 М хлористый натрий) раствора Гб. Смесь вновь перемешивают 60 мин при 10^оС и добавляют 4 мл 5%-ного (маc.) водного (0,15 М хлористый натрий) раствора Гб. Смесь вновь перемешивают 60 мин при той же температуре и прикапывают для завершения реакции 0,26 мл 0,7%-ного (мас.) водного раствора NaBH₄ рН 8. Смесь перемешивают 30 мин и вводят в хроматографическую колонку с сефарозой 6 В, уравновешенной 0,04 М фосфатным буферным раствором рН 7,4. Гельхроматографию ведут при 12^оС со скоростью 13 мл/ч, элюцию проводят 0,04 М фосфатным буферным раствором рН 7,4. Количество связанной СОД 6,2 мг, т.е. 84% от введенного в реакцию количества фермента.

Определение активности проводили известным методом Бейера и Фридовича. Величина активности, показатель ММ ПГб и молярное соотношение СОД: Гб представлены в таблице.

П р и м е р 2. К 1,11 мл 1%-ного (маc.) водного (0,15 М хлористый натрий) раствора СОД рН 7 прибавляют 0,2 мл 1,9%-ного водного раствора ГА. Реакционную смесь перемешивают 45 мин при 15^оС и добавляют 3 мл 5%-ного водного (0,15 М хлористый натрий) раствора Гб. Смесь перемешивают 90 мин при той же температуре и прикапывают для завершения реакции 0,39 мл 0,38%-ного (мас.) водного раствора NaBH₄ рН 8,6. Смесь перемешивают 30 мин. Раствор гельхроматографируют в условиях примера 1. Количество связанной СОД 10,32 мг, т.е. 93% от введенного в реакцию количества фермента.

П р и м е р 3. К 2 мл 0,65%-ного (мас.) водного (0,15 М хлористый натрий) раствора СОД рН 7,4 медленно прибавляют 0,375 мл 1%-ного (мас.) водного раствора ГА при t 12^оС. Реакционную смесь перемешивают 60 мин при той же температуре и добавляют 5 мл 1%-ного (мас.) водного (0,15 М хлористый натрий) раствора Гб. Смесь перемешивают 120 мин при той же температуре, после чего добавляют для завершения реакции 0,55 мин 0,27%-ного (мас.) водного раствора NaBH₄ рН 9. После перемешивания в течение 30 мин смесь гельхроматографируют в условиях примера 1. Количество связанной СОД 9,6 мг, т.е. 74% от введенного в реакцию количества фермента.

П р и м е р 4. К 0,8 мл 0,90%-ного (мас.) водного (0,15 М хлористый натрий) раствора СОД рН 7,2 медленно прибавляют 0,126 мл 1,9%-ного (мас.) водного раствора ГА при 5^оС. Реакционную смесь перемешивают 60 мин при той же температуре и добавляют 2 мл 0,68%-ного (мас.) водного (0,15 М хлористый натрий) раствора гемоглобина. Смесь перемешивают 240 мин при той же температуре. Для завершения реакции добавляют 0,29 мл 0,3%-ного (мас.) водного раствора NaBH₄ с рН 8,2. После перемешивания в течение 30 мин смесь гельхроматографируют в условиях примера 1. Количество ковалентно связанной СОД 4,9 мг, т.е. 68% от введенного в реакцию фермента.

Примеры 5-12 выполнены в условиях примера 1. Все данные сведены в таблицу.

Биологические испытания проведены в Ленинградском HИИ гематологии и переливания крови МЗ РСФСР. Препарат с ММ (130-220) ˙10³ вводили пяти собакам (массой 16-17 кг), 25 крысам (массой 0,20-0,25 кг), 10 кроликам (массой 2-2,5 кг). Препарат вводили шестикратно в течение 2 нед внутривенно (кроликам в ушную вену, крысам в хвостовую вену, собакам в бедренную вену). Через 3 сут после завершения курса введения (1%-ный раствор в дозе от 1 до 4 г/кг массы животного) в почках и селезенке наблюдали незначительные гранулы гемосидерина. Через 14 сут наблюдались только следы гранул. Через 30-45 сут не зафиксировано каких-либо следов.

Анализ экспериментального материала и данных фигур позволяет сделать следующие выводы. Цель изобретения достигнута, во-первых, за счет того, что производное биодеструктируемо в кровеносном русле, во-вторых, оно полностью сохраняет супероксидную активность и одновременно характеризуется высоким уровнем газотранспортной функции, т.е. способностью к обратимой оксигенации дезоксигенации. Высокие ММ конъюгата обеспечивают пролонгированное действие, (период полувыведения иммобилизованной СОД 10-12 ч, период полного выведения исходной СОД около 10 мин), таким образом пролонгация по времени в 60-72 раза больше.

Заявленный способ обеспечивает ковалентное присоединение 68-93% от массы введенной в реакцию СОД, что обеспечивает высокую эффективность способа.

Использование: в биотехнологии, химии высокомолекулярных биологически активных соединений и в биохимической практике для получения стабильного переносчика кислорода, обладающего одновременно пролонгированной антиоксидантной активностью. Сущность изобретения: к водному 0,4 1 мас.-ному раствору супероксиддисмутазы (СОД)с рН 6,8 7,4 добавляют последовательно водный 1 2 мас.-ный раствор глутарового альдегида (ГА) при молярном соотношении СОД ГА 1 (95,4 228) и 0,68 5 мас.-ный раствор гемоглобина (Гб) при молярном соотношении СОД Гб 1 (1 13,4). Целевое производное СОД биодеструктируемо в кровеносном русле, оно полностью сохраняет супероксидную активность и характеризуется высоким уровнем газотранспортной функции, высокие значения ММ обеспечивают пролонгированное действие. Способ обеспечивает ковалентное присоединение к полимеру носителю 68 93% от массы введенной в реакцию СОД. 1 табл. 2 ил.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ, предусматривающий взаимодействие водных растворов гемоглобина, фермента и глутарового альдегида, завершение реакции введением реагента, блокирующего свободные альдегидные и непредельные группы, с последующим выделением целевого продукта хроматографией, отличающийся тем, что взаимодействие проводят последовательным добавлением к водному 0,1 0,4%-ному раствору супероксиддисмутазы (СОД) pH 6,8 7,4 1,0 2,0%-ного водного раствора глутарового альдегида (ГА) при молярном соотношении 1:(95,4 228) соответственно и 0,68 5,0%-ного водного раствора гемоглобина (Гб) при соотношении СОД: Гб. 1:(1 13,4) соответственно и температуре 5 15^oС.