СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИГЕМОГЛОБИНА С ПОВЫШЕННОЙ КИСЛОРОДТРАНСПОРТНОЙ ЭФФЕКТИВНОСТЬЮ Российский патент 1999 года по МПК A61K35/18 A61K38/42 

Изобретение относится к получению полигемоглобина, который может представить основу кровезамещающих растворов с функцией переноса кислорода.

Изобретение может быть использовано для производства кровезамещающих растворов, сопоставимых по эффективности газового транспорта (по переносу кислорода) с эритроцитами крови человека.

Известен способ получения полигемоглобина с повышенной кислородтранспортной эффективностью /1/, который реализуется следующей совокупностью существенных признаков:
I стадия.

1. Модификация гемоглобина (Гб). К 18 мас.% раствору Гб донорской крови в 0,1 М трис-буфере с pH 7,4 добавляют 0,2 мас.% глюкозы, 0,2 мас.% глутатиона и 0,05 мас.% аскорбиновой кислоты.

2. Затем в раствор добавляют пиридоксаль-5-фосфат (ПФ) в молярном отношении ПФ:Гб = 4 : 1.

3. Раствор дезоксигенируют продувкой азотом и добавляют боргидрид натрия.

II стадия.

4. Полимеризация. К водному буферному раствору, содержащему 16 мас.% Гб, модифицированного пиридоксаль-5-фосфатом, добавляют 0,15 мас.% глутатиона и 0,29 мас.% лизина.

5. Раствор охлаждают до +5^oC и при этой температуре при перемешивании добавляют 10 - 15 мас.% водный раствор глутарового альдегида (ГА), массовое соотношение ГА : Гб = 1 : 4 - 5.

6. Реакцию завершают добавлением водного раствора лизина.

Основной характеристикой полученного модифицированного полигемоглобина (ПГб) является величина полунасыщения его кислородом (P₅₀), которую сравнивают с P₅₀ для исходного Гб.

В табл. 1 (см. в конце описания) даны сравнительные величины P₅₀ для модифицированного ПГб и исходного Гб, полученных в известных условиях.

Основным недостатком известного способа является использование для модификации Гб дорогостоящего биологически активного реагента - пиридоксаль-5-фосфата. ПФ вводят в реакционную смесь в избыточных количествах, а затем удаляют из целевого продукта, поскольку свободный ПФ может проявлять нежелательные последствия.

Задачей предлагаемого изобретения являлось создание способа получения ПГб с повышенной кислородтранспортной эффективностью с использованием более технологического модификатора, не обладающего значительной биологической активностью. Эта задача была решена заявленным способом получения полигемоглобина с повышенной кислородтранспортной эффективностью, который реализуется совокупностью следующих существенных признаков:
I стадия.

1. Модификация глутарового альдегида. ГА модифицируют действием модификатора в водном буферном растворе при pH 6,8 - 7,4 и при концентрациях ГА и модификатора 0,1 - 5,0 мас.%, мольное соотношение ГА : модификатор = 1 : 0,2 - 1,2.

2. В качестве модификатора берут вещество из ряда, включающего дикарбоновые аминокислоты (например, аспарагиновую, глутаминовую) и бисульфит натрия.

II стадия.

3. Полимеризация. 1 - 10 мас.% водный раствор Гб донорской крови дезоксигенируют и при 4^o - 24^oC добавляют 1 - 5 мас.% водный раствор модифицированного глутарового альдегида при молярном отношении Гб : связанный модифицирующий агент = 1 : 4 - 24.

4. Реакцию завершают добавлением водного раствора боргидрида натрия.

В выделенном целевом продукте методом гельпроникающей хроматографии определяют ММР (молекулярно-массовое распределение) и оценивают СММ, а также определяют величину P₅₀ из кривых диссоциации оксигемоглобина.

Отличительными от способа-прототипа признаками являются признаки 1 - 3.

Анализ известного уровня техники не позволил обнаружить решение, полностью совпадающее по совокупности существенных признаков с заявленным способом. Это подтверждает новизну предложения.

Анализ известного уровня науки и техники не позволил обнаружить какие-то решения, использующие вышеуказанные отличительные признаки. Новизна отличительных признаков свидетельствует о наличии впервые обнаруженной функциональной зависимости "структура - свойство", что подтверждает соответствие решения условию патентоспособности "изобретательский уровень". Действительно, все ранее известные способы получения ПГб с повышенной кислородтранспортной эффективностью основывались на модификации исходного Гб. В заявленном способе эффект достигнут за счет модификации сшивающего агента - глутарового альдегида.

По каталогу реактивов "Sigma", Chemical Company, 1994, "Biochemical Organic Compounds for Research and Diagnostic reagents" /5/ 1 г пирпидоксаль-5-форсфата стоит 12,1 долларов США, 500 г глутаминовой кислоты (99% чистоты) - 11 долларов.

Гемоглобин получают осмотическим гемолизом отмытых эритроцитов донорской крови /6/. Концентрацию нативного Гб и продуктов его химической модификации определяют спектрофотометрически по цианметгемоглобиновому производству при длине волны λ = 540 нм /7/. Используют 25% водный раствор глутарового альдегида фирмы Реанал (Венгрия), очищенный активированным углем. Концентрацию ГА определяют методом дифференциальной pH-метрии с гидроксиламином /8/. Бисульфит натрия (NaHSO₃) получают непосредственно перед использованием /9/. Его концентрацию определяют йодометрически. Концентрацию аминокислот определяют по реакции с 2,4,6-тринитробензолсульфокислотой /10/.

ММ целевого ПГб определяют на основе ММР методом гельпроникающей хроматографии на сефарозе 6Б в фосфатном буфере при нейтральных pH. Расчеты ведут по разработанному авторами способу /11/.

Кривые диссоциации оксигемоглобина получают на регистрирующем приборе "Гем-О-ксан" (фирма Amico, US) в стандартных условиях (pH 7,4; 37^oC) в диапазоне парциальных давлений кислорода от 0 до 180 торр, достигаемых продуванием азота или смеси азот - кислород (75 : 25 v/v) без добавления CO₂. На основании кривых диссоциации оксигемоглобина определяют величину полунасыщения Гб кислородом (P₅₀). Все пробы Гб и модифицированного ПГб предварительно отдиализоваывают против 0,05 М трис-HCl буфера с 0,15 M NaCl, pH 7,4. Погрешность в определении P₅₀ составляет 10 - 15%. Разброс данных по P₅₀ зависит, прежде всего, от полноты удаления 2,3-дифосфоглицерата из раствора исходного Гб, времени хранения Гб, степени его автоокисления (содержания метформы), а также отражает статистический характер процесса модификации молекулы Гб при ее сшивке. В каждом случае величина P₅₀ целевого ПГб сравнивается с величиной P₅₀ исходного Гб.

Для подтверждения соответствия заявленного способа условию "промышленная применимость" и для лучшего понимания сущности предложения приводим примеры конкретной реализации изобретения.

Пример 1. Получение модифицированного ПГб в условиях способа - прототипа: модификация Гб пиридоксаль-5-фосфатом и сшивка глутаровым альдегидом.

20 мл 5 мас.% водного раствора Гб из донорской крови с pH 7,0 продувают азотом при 10^oC до перехода Гб в дезоксиформу. Затем при перемешивании раствора в токе азота добавляют 1,6 мл 1 мас.% водного раствора пиридоксаль-5-фосфата в 0,1 М трисбуфере с pH 7,0. После перемешивания в течение 1 часа при 10^oC добавляют 0,25 мл 0,1 мас.% водного раствора боргидрида натрия с pH 8,0. К водному раствору модифицированного Гб при 10^oC в токе азота добавляют 2,5 мл водного 2 мас.% раствора глутарового альдегида. Реакцию проводят в течение 1 часа и завершают введением в реакционную смесь 1 мл 0,1 мас.% раствора боргидрида натрия с pH 8,0.

Полученный пиридоксилированный ПГб выделяют гельхроматографически. Выход по Гб 100%. Содержание пиридоксаль-5-фосфатных групп и иные характеристики представлены в табл. 2 (см. в конце описания)
Примеры 1 - 5 проведены в идентичных условиях.

Пример 6. Получение ПГб путем сшивки Гб глутаровым альдегидом, модифицированным глутаминовой кислотой.

40 мл водного раствора Гб донорской крови с концентрацией 5,0 мас.% с pH 7,0 помещают в колбу емкостью 200 мл и проводят дезоксигенацию в токе азота при перемешивании при 12^oC. К раствору дезоксигенированного Гб прикапывают 3,1 мл водного раствора с концентрацией 2 мас.% по ГА и 1,47 мас.% по глутаминовой кислоте в 0,1 М фосфатном буферном растворе с pH 7,0. Реакцию ведут при перемешивании в течение 1 часа, затем добавляют 52,4 мл 1 мас.% водного раствора натрий боргидрида с pH 9,0. Перемешивают еще 30 мин. Отбирают 1 мл реакционной смеси, проводят диализ против 2 л 0,05 М раствора трис-буфера с pH 7,4, содержащего 0,15 М NaCl, в течение суток. В подготовленной таким образом пробе измеряют кривую диссоциацию оксигемоглобина. Для сравнения измеряют кривую диссоциации оксигемоглобина в исходном растворе Гб, отдиализованном в тех же условиях. Для целевого продукта P₅₀ 23 торр, для исходного Гб 15 торр. ММ ( ) для целевого продукта составляет 2,3 • 10⁵ Д.

Примеры 7 - 11 выполнены в условиях примера N 6, все данные по примерам 6 - 11 представлены в табл. 3 (см. в конце описания).

Пример 12. Получение ПГб путем сшивки Гб глутаровым альдегидом, модифицированным бисульфитом натрия.

В колбу на 51 мл помещают 10 мл водного раствора Гб с концентрацией 4,7 мас. % с pH 7,0 и проводят дезоксигенацию Гб продуванием азота при 12^oC. К раствору дезоксигенированонго Гб при той же температуре и при перемешивании добавляют 0,84 мл физиологического раствора с концентрацией по ГА 1,74 мас.% и по бисульфиту натрия 0,73 мас.%. Смесь перемешивают 1 час. Реакцию останавливают добавлением 0,5 мл 1,0 мас.% водного раствора боридрида натрия с pH 8,5 с последующим перемешиванием в течение 30 минут. В условиях примера 1 выделяют целевой продукт и проводят его характеристику.

Примеры 13 и 14 выполнены в условиях примера 12. Все данные по примерам 12 - 14 представлены в таблице 3.

Анализ представленных примеров показывает, что поставленная задача решена. Получен модифицированный ПГб с сохранением водорастворимости и высокой кислородтранспортной эффективностью. При этом модификацию проводят не исходного Гб, как это реализовано всеми известными способами, а сшивающего агента - глутарового альдегида. В качестве модификаторов используют существенно более технологичные вещества из ряда, включающего дикарбоновые аминокислоты и бисульфит натрия.

Сущность заявленного изобретения не исчерпывается только приведенными примерами с конкретными дикарбоновыми аминокислотами и бисульфатом натрия в качестве модификаторов. Можно ожидать, что эффективными окажутся и иные дикарбоновые аминокислоты, а также ди- и поликарбоновые пептиды при их использовании в качестве модификаторов сшивающих агентов.

Можно указать, что дополнительным преимуществом заявленного способа является повышенный эффект модификации: в таблице 3 показано, что соотношение P₅₀ ПГб/P₅₀ Гб равно 1,35 - 2,25, а в таблице 2 те же соотношения для ПГб, полученного в условиях способа-прототипа, не превосходят 1,07 - 1,55.

Источников информации
1. L. R. Sehgal, A. L. Rosen, S. A. Gould, H.L. Sehgal, G.S. Moss / Transfusion. - 1983. - v. 23. - N 2. - P. 158-162.

2. F. De-Venuto / Biomaterials Artificial Cells and Artificial Organ. - 1988. - v. 16. - N 1-3. - P. 77-83.

3. L.R. Sehgal, H.L. Sehgal, A.L. Rosen, S.A. Gould, R. De-Woskin, G.S. Moss / ibid. - P. 173-183.

4. P.E. Keipert, T.M. Chang / ibid. - P. 185-196.

5. Biochemical Organic Compounds for Research and Diagnostic reagents, Sigma, Chem. Company, 1994.

6. S.E. Rabiner / J. Exp. Med. - 1967 - v. 126. - N 6. - P. 1127-1132.

7. М. С. Кушаковский /Клинические формы повреждения гемоглобина. Л.: Медицина. - 1968. - С. 23.

8. H. R. Roe, G. Mitchel / Analyt. Chem. - 1951 - v. 23. - N 12. - P. 1758-1760.

9. Ю. В. Карякин, И.И. Ангелов / Чистые химические реактивы, М.: ГНТИ, хим. л-ра. - 1955. - С. 397-398.

10. R. Fields / Biochem. J. - 1971. - v. 124. - P. 581-590.

11. Н.П. Кузнецова, Г.В. Самсонов / Высокомолекул. соединения. - 1985. - сер. А. - т. 27. - N 12. - С. 2611 - 2614.

Способ включает взаимодействие дезоксигемоглобина с бифункциональным сшивающим агентом в буферном растворе с рН 6,8 - 7,4 при мольном отношении гемоглобин : сшивающий агент = 1 : (4 - 24). Реакция завершается добавлением вещества, закрывающего оставшиеся функциональные группы сшивателя. В качестве сшивателя используют глутаровый альдегид, модифицированный веществом из ряда, содержащего дикарбоновую аминокислоту (например, аспарагиновую, глутаминовую) и бисульфит натрия. Модификацию ведут взаимодействием 0,1 - 5,0 мас. % растворов глутарового альдегида и модификатора и при их молярном отношении 1 : 0,2 - 1,2. Способ позволяет проводить модификацию не исходного гемоглобина, как это реализовано всеми известными методами, а сшивающего агента - глутарового альдегида. 1 з.п.ф-лы, 3 табл.

1. Способ получения полигемоглобина с повышенной кислородтранспортной эффективностью путем взаимодействия дезоксигенированного гемоглобина с глутаровым альдегидом в буферном растворе с предварительной модификацией одного из взаимодействующих компонентов и с завершением реакции добавлением вещества, закрывающего функциональные группы сшивателя, отличающийся тем, что глутаровый альдегид модифицируют в буферном растворе при рН 6,8 - 7,4 при концентрации альдегида и модификатора 0,1 - 5,0 мас.% и при молярном соотношении глутаровый альдегид : модификатор, равном 1:(0,2 - 1,2), а взаимодействие дезоксигенированного гемоглобина с модифицированным глутаровым альдегидом ведут при мольном отношении гемоглобин : связанный модифицирующий агент 1:(5 - 24). 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве модификатора используют вещество из ряда, включающего дикарбоновую аминокислоту (например, аспарагиновую, глутаминовую) и бисульфит натрия.