СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИМЕРНОГО МОДИФИЦИРОВАННОГО ГЕМОГЛОБИНА Российский патент 2014 года по МПК A61K35/18 A61K38/42 A61P7/00 C07K14/805 

Изобретение относится к области медицины, в частности, - трансфузиологии и касается кровезамещающих препаратов с функцией переноса кислорода на основе гемоглобина.

В настоящее время известны способы получения гемоглобина, одним из которых гемоглобин получают в результате разрушения эритроцита. Другой способ основан на дезоксигенации гемоглобина донорской крови в водном растворе. Также известен способ получения кровезаменителя, где для получения дезоксигенированного гемоглобина используют свободную от лейкоцитов эритроцитарную массу, осаждают негемовые белки, после их удаления осуществляют концентрирование раствора гемоглобина ультрафильтрацией. Кроме того, известен способ, в котором их крови и эритроцитарной массы удаляют лейкоциты и тромбоциты, отмывают и лизируют эритроциты, переводят гемоглобин эритроцитов в СО-форму, подвергают фильтрации и тепловой обработке [RU 2162707, 24.03.1999; RU 2203087, 27.04.2003; RU 2341286, 20.12.2008].

Существенными и очевидными недостатками указанных аналогов являются следующие. Гемоглобин, полученный в результате разрушения эритроцитов, при введении в кровеносное русло быстро выводится из крови через почки, необратимо повреждая их из-за нефротоксичности. В другом случае при введении молекул гемоглобина в кровеносные сосуды он распадается на две отдельные единицы, которые также обладают нефротоксичностью и обладают, побочны отрицательным воздействием на микрофлору дыхательных путей и пищеводного тракта. Эти недостатки существенно снижают ценность получаемых препаратов и ограничивают его использование.

Наиболее близким по сущности и достигаемому результату является способ получения полигемоглобина с повышенной кислородтранспортной эффективностью, включающий предварительную обработку и модификацию исходных компонентов, проведение реакции поликонденсации, введение терминатора [RU 2132687, А61К 35/18, 38/42; 10.07.1999]. В этом способе осуществляют реакцию взаимодействия дезоксигенированного гемоглобина с глутаровым альдегидом в буферном растворе с предварительной модификацией одного из взаимодействующих компонентов - глутарового альдегида и с завершением реакции добавлением вещества, закрывающего функциональные группы сшивателя.

Обладая преимуществом перед аналогами, данный способ получения полигемоглобина также скрывает в своей сущности очевидные и существенные недостатки, заключающиеся в недостаточной газотранспортной активности получаемого гемоглобина в связи с незначительными размерами его молекул и кратковременности его функционирования в кровеносной системе, что не позволяет получить эффективные показатели по кислородоснабжению органов, не устраняет его нефротоксичность и шоковые состояния индивида после введения гемоглобина. Эти недостатки заложены в процессе выбора компонентов, их обработке, последовательности операций, режимов и параметров их проведения, не позволяющих получить полифункциональный кровезамещающий раствор, который мог бы быть способным инициировать собственное кроветворение.

Технической задачей и положительным результатом изобретения является получение полимерного модифицированного гемоглобина с более высоким классом его эффективности в виде полифункционального кровезамещающего раствора с функцией эффективного переноса кислорода, обладающего противошоковым и гемодинамическим действием, способным инициировать собственное кроветворение; получение препарата с более высокими физико-химическими и биологическими свойствами: антиоксидантным, противовоспалительным и иммуномодулирующим - для восстановления нормальной жизнедеятельности организма.

Указанная техническая задача и эффект достигается за счет разработанного способа получения полимерного модифицированного гемоглобина, высокая эффективность которого проверена заявителями доклиническими и клиническими испытаниями.

Способ получения полимерного модифицированного гемоглобина включает предварительную обработку и модификацию исходных компонентов, проведение реакции поликонденсации, введение терминатора, при этом ведут ступенчатую поликонденсацию выделенного из эритроцитарной массы очищенного гемоглобина в смешанной окси/дезокси форме с синтезированным полифункциональным сшивающим агентом-производным глутарового альдегида с диполярными ионами из ряда моноаминокарбоновых и моноаминодикарбоновых кислот и пептидов на их основе, где на первой стадии реакции ведут внутримолекулярную химическую сшивку лабильной в водном растворе молекулы гемоглобина, а на второй стадии проводят межмолекулярную сшивку уже модифицированных молекул гемоглобина с образованием полимерного модифицированного гемоглобина.

Способ характеризуется тем, что реакцию гемоглобина в смешанной окси/дезокси форме с полифункциональным сшивающим агентом проводят в токе азота или аргона при температуре 4-15°С.

Способ характеризуется также тем, что в качестве терминатора реакции используют восстановительные системы: боргидрид натрия и бисульфит натрия в диапазоне мольных соотношений от 1 до 100%.

Пример осуществления способа.

Гемоглобин (Гб) получают осмотическим гемолизом эритроцитов донорской крови, очищенный от клеточных и плазменных компонентов методами скоростного центрифугирования и многократной мембранной ультра- и диафильтрацией. Объем 5 г % р-ра Гб 100 мл.

Сшиватель - производные глутарового альдегида (ГА) с глутаминовой кислотой (ГК) или глутаматом натрия (Гm) в водном 0,9% растворе NaCl (физиологический р-р). Реакцию ГА с ГК проводили при t=10°C в токе инертного газа (азота, аргона). К 5,2 мл 3 г % ГА приливали 6 мл раствора ГК (5,6 г% р-р) в 6 мл физ. растворе (0,9% NaCl) или раствора Гm рН=6,8 (3,5 мг глутамата натрия в 6 мл физ. раствора). Общий объем сшивателя 11,2 мл.

Получение полимерного модифицированного Гб (полигемоглобина, ПГб).

100 мл 5 г% раствора Гб в 0,9% NaCl pH=6,85 (pH может быть от 6,4÷7,4 - эта область pH максимальной физиологической активности Гб, выше и ниже он подвержен автоокислению) помещают в колбу (реактор) емкостью ~200 мл. Реакция идет при постоянном перемешивании в токе инертного газа при t=10°C (интервал t° от 6 до 22°С, ниже 6°С реакция замедляется, а выше 22° - возможно автоокисление). Сшиватель добавляют в 2 приема (2 стадии).

на I стадии к дезоксигенированному Гб добавляют половину сшивателя (5,6 мл) - в результате образуется ПГб1 с ММ (молекулярной массой средневесовой) 72-128 кДа - это смесь мономера и димера Гб (ММ_Гб=65 кДа) (таблица №1).

на II стадии добавляется вторая половина сшивателя (5,6 мл). На этой стадии ММ_ПГб-2 достигает 230-320 кДа, что соответствует 3-5-мерам полигемоглобина.

Реакцию останавливают добавлением восстановителя натрий боргидрида (NaBH₄) (60 мг в 10 мл р-ра) или бисульфита натрия (NaHSO₃) (164 мг в 12 мл раствора), возможно их последовательное добавление (50/50) каждого в половинном количестве. Реакция идет при перемешивании в течение 30 минут.

После чего отключают ток инертного газа, полученный раствор ПГб сливают и проводят исследования:

1) Гельпроникающая хроматография (ГПХ) на сефорозе 6Б, уравновешенной 0,05 М фосфатным буфером рН=7,2. Определяется молекулярно-массовое распределение, рассчитываются средневесовые молекулярные массы ПГб (по калибровке), и содержание высокомолекулярных и низкомолекулярных фракций ПГб-2.

2) Кислородтранспортную функцию ПГб оценивали на приборе Гем-O-Скан, снимали кривые диссоциации оксигемоглобина (КДО) - зависимость степени насыщения ПГб кислородом от парциального давления кислорода (pO₂). Характеристикой эффективности кислородного транспорта служит величина Р₅₀ - парциальное давление кислорода при 50% насыщении Гб или ПГб кислородом. Для сравнения образцы Гб и ПГб диализовали против 0,05 М трис-HCl буфера в 0,9% NaCl (pH=7,4). КДО снимали при 37°С в диапазоне перепада парциального давления кислорода (pO₂) в интервале 0-16 - мм Hg.

Преимущества двухстадийной подачи сшивателя:

1. Наблюдается стабильная воспроизводимость результатов (таблица №2) по ММ и фракционному составу.

2. Содержание низкомолекулярной фракции ПГб-2 (~65 кДа) снижается до 2-8%, а выход полимерной фракции достигает 92-98%.

3. При этом повышается эффективность газового транспорта ПГб-2 (по сравнению с Гб) (из КДО) величина Р₅₀ увеличивается ~ в 1,5 раза.

Результаты осуществления способа сведены в таблицы 1 и 2.

Использование в качестве модификатора для ГА вместо ГК - глутамата натрия (Гm) дает более равномерное молекулярно-массовое распределение.

Гm хорошо растворим в воде: (ГК растворяется только при подщелачивании, медленно). Использование Гm, дает стандартное рН раствора (6,7-6,8), и сокращает стадию при получении сшивателя.

Изобретение относится к области медицины, в частности трансфузиологии, а именно к способу получения полимерного модифицированного гемоглобина путем ступенчатой поликонденсации выделенного из эритроцитарной массы очищенного гемоглобина в смешанной окси/дезокси форме с синтезированным полифункциональным сшивающим агентом - глутаровым альдегидом с глутаминовой кислотой и глутаматом натрия, где на первой стадии реакции ведут внутримолекулярную химическую сшивку лабильной в водном растворе молекулы гемоглобина, а на второй стадии - межмолекулярную сшивку уже модифицированных молекул гемоглобина с образованием полимерного модифицированного гемоглобина. Изобретение обеспечивает получение более эффективного полимерного модифицированного гемоглобина в виде полифункционального кровезамещающего раствора с функцией эффективного переноса кислорода, обладающего противошоковым и гемодинамическим действием, способным инициировать собственное кроветворение. 2 з.п. ф-лы, 1 пр., 2 табл.

1. Способ получения полимерного модифицированного гемоглобина, включающий предварительную обработку и модификацию исходных компонентов, проведение реакции поликонденсации, введение терминатора, отличающийся тем, что ведут ступенчатую поликонденсацию выделенного из эритроцитарной массы очищенного гемоглобина в смешанной окси/дезокси форме с синтезированным полифункциональным сшивающим агентом глутаровым альдегидом с глутаминовой кислотой и глутаматом натрия, где на первой стадии реакции ведут внутримолекулярную химическую сшивку лабильной в водном растворе молекулы гемоглобина, а на второй стадии проводят межмолекулярную сшивку уже модифицированных молекул гемоглобина с образованием полимерного модифицированного гемоглобина.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что реакцию гемоглобина в смешанной окси/дезокси форме с полифункциональным сшивающим агентом проводят в токе азота или аргона при температуре 4-15°С.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве терминатора реакции используют восстановительные системы: боргидрид натрия и бисульфит натрия в диапазоне мольных соотношений от 1 до 100%.