СРЕДА ДЛЯ РАЗБАВЛЕНИЯ И ЗАМОРАЖИВАНИЯ СПЕРМЫ БАРАНОВ Российский патент 1995 года по МПК A61D19/04 

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности, к искусственному осеменению сельскохозяйственных животных, например, овец.

Известны среды для разбавления и замораживания спермы баранов, включающие дисахара, желток куриного яйца, глицерин, буферные компоненты, ксилит, а также полисахариды: гуммиарабик, декстрин.

Однако известные среды обладают недостаточными криозащитными свойствами из-за отсутствия в них мембрано-тропных веществ, оказывающих влияние на конформационное состояние мембран сперматозоидов при замораживании, вследствие чего сперма, разбавленная и замороженная в этих средах, имеет недостаточную подвижность сперматозоидов после оттаивания и неудовлетворительную для практики оплодотворяемость овец.

Наиболее близка по технической сущности к нашему изобретению синтетическая среда для замораживания спермы баранов, которая содержит следующие компоненты, Дисахарид (лактоза или сахароза) 5,0-8,0 Ксилит 0,1-0,3 Трис-(оксиметил)-ами- нометан 0,065-0,13 Динатриевая двуводная соль этилендиамин-тет- рауксусной кислоты 0,08-0,16 Декстрин 3,5-7,0 Желток куриного яйца 12,0-15,0 Глицерин 3,5-6,0 Вода дистиллирован- ная Остальное
Однако эта среда также обладает недостаточным холодозащитным действием, так как в ее составе отсутствуют мембранотропные вещества, обладающие действием снижать микровязкость плазматических мембран половых клеток, что отрицательно влияет на биологическую полноценность спермиев после замораживания-оттаивания.

Кроме того, данная среда обладает низкими антиоксидантными свойствами на спермии животных, так как в ней отсутствуют вещества с антиоксидантным действием, что повышает уровень перекисного окисления липидов в процессе криоконсервации, продукты которого оказывают токсическое влияние на сперматозоиды и тем снижают результативность осеменения.

Целью изобретения является повышение биологической полноценности и оплодотворяющей способности сперматозоидов после глубокого замораживания.

Поставленная цель достигается тем, что среда, включающая дисахарид, ксилит, трис-(оксиметил)-аминометан, двунатриевую двуводную соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, желток куриного яйца, глицерин и воду, дополнительно содержит ИХФГАН-3 при следующем соотношении ингредиентов, мас. Дисахарид (лактоза или сахароза) 5,0-8,0 Ксилит 1,0-0,3 Трис-(оксиметил)-ами- нометан 0,065-0,13 Двунатриевая двувод- ная соль этилендиами- нтетрауксусной кислоты 0,08-0,16 Декстрин 3,5-7,0 Желток куриного яйца 12,0-15,0 Глицерин 3,5-6,0 ИХФГАН-3 0,004-0,016 Вода дистиллирован- ная Остальное
ИХФГАН-3 бромид-N,N-диметил-N-гексадецил-4-окси-3,5-ди-трет- бутил-бензил-амина:

где R=C(CH₃)₃
Указанная четвертичная соль синтезируется в одну стадию из доступного промышленного продукта N,N-диметил-4-гидрокси-3,5- ди-трет-бутилбензиламина согласно следующей схемы:
_{_→} при взаимодействии N, N-диметил-4-гидрокси-3,5-ди-трет- бутилбензилбромида с Н-гексадецилбромидом в среде ацетона при температуре 23-25^оС образуется желаемая четвертичная соль (ИХФГАН-3) с выходом до 75% Эта соль представляет собой мелкокристаллический белый порошок с температурой плавления 126-127^оС. Структура полученной соли подтверждена данными ИК и ПМР-спектроскопии.

В составе синтетических сред для спермы животных ранее не применялся. Он обладает двойным действием на спермии: во-первых, как фенольный жирорастворимый антиоксидант, способен быстро встраиваться в плазматическую мембрану и изменять ее конформационное состояние путем снижения микровязкости мембраны; во-вторых вследствие наличия в структуре фрагмента 2,6-ди-трет-бутилфенола, он обладает мощным антиоксидантным действием и препятствует развитию перекисного окисления липидов при замораживании спермы. Эти свойства препарата позволяют, как показали наши опыты, повысить сохранность сперматозоидов во время замораживания, увеличить продолжительность их живучести и увеличить оплодотворяющую способность оттаянной спермы.

Предлагаемая среда повышает криоустойчивость и оплодотворяющую способность сперматозоидов. При введении ИХФГАН-3 в состав криоконсервированной среды оптимальной дозой является 0,008% препарата (табл.1).

Допустимые граничные значения концентраций компонентов в заявленной среде приведены в табл.2.

Если содержание ингредиентов выходит за границу крайних нижних или верхних значений предлагаемой среды, то это дает худшие результаты и не приводит к достижению поставленной цели (см. табл.3).

П р и м е р. В чистую химическую колбу вносят по рецепту лактозу, ксилит, трис-(оксиметил)-аминометан, двунатриевую двухводную соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, декстрин, заливают прокипяченной дистиллированной водой (80-90^оС). Колбу помещают в кипящую водяную баню до полного растворения всех компонентов. Раствор охлаждают до 40^оС и вносят туда желток куриного яйца, глицерин и ИХФГАН-3, который предварительно растворяют в желтке куриного яйца.

Свежеприготовленная среда перед разбавлением спермы должна быть исследована по внешнему виду, цвету, запаху и периодически по показателю рН и осмотическому давлению. Предлагаемая синтетическая среда по физико-химическим свойствам должна отвечать следующим требованиям: внешний вид однородная эмульсия без осадка и механических примесей, цвет от темно-желтого до светло-коричневого, без запаха, рН 6,8±0,1, осмотическое давление (без глицерина) 6,0-10,0.

Приготовленную среду используют для разбавления спермы в течение 5-6 ч. Хранят при температуре 4-18^оС, перед употреблением нагревают до 30-35^оС. При использовании среды к 1 объему спермы добавляют 3 или 4 объема среды в зависимости от концентрации сперматозоидов.

Оптимальный (второй) состав предлагаемой среды (мас.): лактоза 5,8; ксилит 0,18; трис-(оксиметил)-аминометан 0,1; двунатриевая двухводная соль этилендиаминтетрауксусной кислоты 0,13; декстрин 5,5; желток куриного яйца 14,0; глицерин 5,2; ИХФГАН-3 0,008; вода дистиллированная до 100, имеет более высокие криозащитные свойства в сравнении с другими вариантами и прототипом. Подвижность сперматозоидов в ней после оттаивания составляет 4,5±0,01 баллов и абсолютный показатель выживаемости 17,5±0,7 усл.ед. против 4,2±0,07 и 14,0±0,5 в контроле (прототип).

Указанный оптимальный состав среды испытан комиссией в производственных условиях на оплодотворяющую способность при однократном осеменении овец в течение эструса в Хакасской республике. Результаты испытаний представлены в табл.4.

Испытания показали, что предложенная среда обладает более высокими криозащитными свойствами: суягность овец при однократном осеменении возросла на 9% по сравнению с контролем.

Преимущества заявленной синтетической среды над прототипом повышение подвижности, выживаемости и оплодотворяющей способности спермы после глубокого замораживания и оттаивания.

Использование: искусственное осеменение животных. Сущность изобретения: среда с целью повышения биологической полноценности и оплодотворяющей способности сперментов после замораживания дополнительно содержит бромид-M, N-диметил N-гексадецил-4-окси-3,5-ди-трет-бутил-бензил-амина в количестве 0,004-0,016 мас. 4 табл.

СРЕДА ДЛЯ РАЗБАВЛЕНИЯ И ЗАМОРАЖИВАНИЯ СПЕРМЫ БАРАНОВ, включающая локтозу или сахарозу, ксилит, декстрин, трис-(оксиметил)-аминометан, двунатриевую двухводную соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, желток куриного яйца, глицерин и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что среда дополнительно содержит бромид-N, N-диметил-N-гексадецил- 4-окси-3,5-ди-трет-бутил-бензиламина при следующем соотношении ингредиентов, мас.

Лактоза или сахароза 5,0 8,0
Ксилит 0,1 0,3
Трис-(оксиметил)-аминометан 0,065 0,13
Двунатриевая двухводная соль этилендиаминтетрауксусной кислоты 0,08 - 0,16
Декстрин 3,5 7,0
Желток куриного яйца 12,0 15,0
Глицерин 3,5 6,0
Бромид-N, N-диметил-N-гексадецил-4-окси-3,5-ди-трет-бутил-бензиламина 0,004 0,016
Дистиллированная вода Остальное