СИНТЕТИЧЕСКАЯ СРЕДА ДЛЯ ЗАМОРАЖИВАНИЯ СПЕРМЫ БЫКОВ Российский патент 2008 года по МПК A61D19/02 

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к способам обработки и замораживания семени быков.

Известно, что в процессе замораживания спермы быков погибает 50-60% сперматозоидов и после оттаивания живучесть сперматозоидов в половых путях коров значительно снижается по сравнению с нативными половыми клетками, что отрицательно сказывается на оплодотворяемости коров при использовании криоконсервированной спермы.

В этой связи необходима разработка более совершенных синтетических разбавителей для спермы быков, способствующих повышению устойчивости сперматозоидов к замораживанию и не содержащих в своем составе веществ животного происхождения с целью профилактики заболеваний, которые могут распространяться при искусственном осеменении коров.

Известна синтетическая среда для разбавления и замораживания спермы быков, содержащая лактозу, глицерин, желток куриного яйца и дистиллированную воду (1).

Также известна среда для криоконсервации спермы быков, содержащая лактозу, восстановленный глутатион, трис-(гидроксиметил)-аминометан, серицин, глутаминовую кислоту, желток куриных яиц, спермосан-3 и дистиллированную воду (2).

Недостатком данных сред является то, что при их применении для замораживания спермы быков наблюдается довольно высокая гибель сперматозоидов и живучесть оттаянных сперматозоидов в половых путях коров резко снижается в связи с недостаточным содержанием в среде буферных соединений. Кроме того, наличие в данных средах веществ животного происхождения (лактоза, желток куриных яиц) может способствовать переносу различных заболеваний коровам при их искусственном осеменении, в том числе и птичьего гриппа, в результате возможного содержания различных возбудителей как в желтке, так и в скорлупе куриных яиц. Помимо этого, присутствие в составе этих сред желтка куриных яиц не позволяет выявлять наличие различных патогенных бактерий и вирусов в криоконсервированной сперме быков с помощью полимеразной цепной реакции, так как ферменты, содержащиеся в яичном желтке, ингибируют протекание данной реакции. Это приводит к тому, что большое количество патогенных организмов не выявляется в сперме, используемой для искусственного осеменения коров в нашей стране, и таким способом передаются различные заболевания крупного рогатого скота.

Наиболее близкой по составу к нашему изобретению является среда для замораживания спермы быков (3), которая содержит следующие компоненты (мас.%): трис-(гидроксиметил)-аминометан - 2,4; фруктоза - 1,0; лимонная кислота - 1,354; глицерин - 8,8; желток куриного яйца - 20; вода дистиллированная - остальное.

Недостаток этой среды состоит в том, что она содержит вещество животного происхождения (желток куриного яйца), что может способствовать переносу заболеваний при искусственном осеменении коров. Кроме того, другие компоненты этой среды не сбалансированы в оптимальном соотношении, что снижает живучесть заморожено-оттаянных сперматозоидов в половых путях самок и их оплодотворяющую способность.

Целью изобретения является повышение биологической полноценности синтетической среды для замораживания спермы быков путем исключения из ее состава вещества животного происхождения (желтка куриного яйца) и более оптимального баланса всех компонентов синтетической среды.

Поставленная цель достигается тем, что среда, включающая трис-(гидроксиметил)-аминометан, фруктозу, лимонную кислоту, глицерин и дистиллированную воду, дополнительно содержит в качестве криопротектора вместо желтка куриного яйца сухой соевый лецитин (Центролекс Ф) при следующем соотношении ингредиентов, (мас.%):

Трис-(гидроксиметил)-аминометан- 2,65-2,85Фруктоза- 0.70-0,80Лимонная кислота-1,3-1,5Глицерин- 5-7Сухой соевый лецитин (Центролекс Ф)- 8-12Вода дистиллированная- остальное

Сухой соевый лецитин (Центролекс Ф) получают из экстракта фосфолипидов соевых бобов путем лиофильной сушки. Он имеет постоянный биохимический состав и содержит 98% фосфолипидов, обладающих криопротекторным действием на сперматозоиды быков при замораживании, аналогично действию фосфолипидов желтка куриного яйца. Это позволяет заменить в составе замораживающей среды для спермы быков желток куриного яйца на сухой соевый лецитин данной марки.

Допустимые граничные значения концентраций компонентов в заявленной среде приведены в таблице 1.

Таблица 1Компоненты среды и качественные показатели оттаянной спермы быковСостав сред (мас.%)1-й2-й3-йТрис-(гидроксиметил)-аминометанан2,652,752,85Фруктоза0,700,800,90Лимонная кислота1,301,401,50Глицерин5,06,07,0Сухой соевый лецитин (Центролекс Ф)8,09,010,0Вода дистиллированнаядо 100до 100до 100Показатели замороженно-оттаянной спермы:   Подвижность сперматозоидов,%40,045,038,0Абсолютный показатель живучести сперматозоидов при 37°С, усл.ед.16,317,416,0

Если содержание компонентов выходит за границу крайних нижних или верхних значений предполагаемой среды, то это дает худшие результаты и не приводит к достижению поставленной цели (см. табл.2).

Таблица 2Компоненты сред и показатели качества оттаянной спермыКачественные показатели спермы при следующем содержании компонентов, мас.%Трис-(гидроксиметил)-аминометан2,62,9Фруктоза0,651,55Лимонная кислота1,201,60Глицерин4,08,0Сухой соевый лецитин6,012,0Вода дистиллированнаядо 100до 100Показатели:  Подвижность сперматозоидов после оттаивания, %36,032,0Абсолютный показатель живучести  сперматозоидов при 37°С, усл.ед.15,415,0

Пример приготовления среды. В чистую химическую колбу вносят по рецепту трис-(гидроксиметил)-аминометан, фруктозу, лимонную кислоту и заливают прокипяченной дистиллированной водой с температурой 80-90°С. Тщательно растворяют все компоненты. Затем раствор охлаждают до 40°С и вносят туда глицерин и сухой соевый лецитин. Свежеприготовленная среда перед разбавлением спермы должна исследоваться по внешнему виду, цвету и периодически по показателю рН и осмотическому давлению. Предлагаемая синтетическая среда по физико-химическим свойствам должна отвечать следующим требованиям: внешний вид - однородная эмульсия без осадка; цвет - светло-желтый; без запаха; рН - 6,8-7,0; осмотическое давление - 7,0-8,5.

Приготовленную среду используют для разбавления спермы в течение 4-5 часов.

После разбавления сперму быков эквилибрируют при 4°С в течение 2-3 часов и затем замораживают в виде гранул объемом 0,2 мл на пластине сухого льда или в пайетах объемом 0,25-0,5 мл в парах жидкого азота.

Оптимальный (второй) состав предлагаемой среды (мас.%): трис-(гидроксиметил)-аминометан - 2,75; фруктоза - 0,80; лимонная кислота - 1,40; глицерин-6,0; сухой соевый лецитин - 9,0; вода дистиллированная - до 100, имеет более высокие защитные свойства в сравнении с другими вариантами и прототипом и повышает биологическую полноценность спермы в процессе замораживания-оттаивания. Подвижность сперматозоидов, замороженных в данной среде, после оттаивания составляла 45% против 40% в контроле (прототип), а абсолютный показатель их живучести при 37°С составлял соответственно 17,4 и 16.5 усл.ед.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

ПРИМЕР 1

Указанный оптимальный состав среды испытан комиссионно в производственных условиях на оплодотворяющую способность криоконсервированной спермы быков. Эксперименты проведены в хозяйствах Московской области. Результаты испытаний представлены в таблице 3.

Таблица 3Синтетическая средаОсеменено коровОплодотворилось от первичного осемененияКоровв %Предлагаемая (оптимальный вариант)1236351,2Контроль (прототип)1065047.2

Испытания показали, что предложенная среда обладает более высокими защитными свойствами на сперматозоиды быков при замораживании: оплодотворяемость коров при использовании спермы, замороженной с сухим соевым лецитином, повысилась на 4,0% по сравнению с контролем.

ПРИМЕР 2

Было изучено выяснение возможности определения присутствия вируса инфекционного ринотрахеита (ИРТ) и лептоспир в криоконсервированной сперме быков с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для этого свежеполученные эякуляты от трех быков смешивали и разделяли на две части. Первая часть спермы разбавлялась и замораживалась в усовершенствованной среде с добавлением 10% желтка куриных яиц. Вторая часть спермы разбавлялась и замораживалась в этой же среде, но с добавлением вместо желтка куриных яиц 10% сухого соевого лецитина. В одной дозе содержалось 20 млн подвижных сперматозоидов. После оттаивания спермы в нее вносили определенную концентрацию вируса ИРТ и определяли его присутствие в оттаянной сперме всех групп быков с помощью ПЦР реакции.

Кроме того, нами изучалось присутствие лептоспир в криоконсервированой сперме данным методом. Для этого к 1 мл оттаянной спермы добавляли 1000, 100 или 10 лептоспир.

Результаты выделения вируса ИРТ в оттаянной сперме показали, что в случае использования в составе среды сухого соевого лецитина антигены данного вируса выявлялись отчетливо. В случае замораживания спермы с желтком куриного яйца присутствие антигенов ИРТ не обнаруживалось.

Анализ эксперимента по выделению антигенов лептоспир в криоконсервированной сперме быков показал, что использование в разбавителе сухого соевого лецитина позволило обнаружить антигены лептоспир даже в низкой концентрации (100 и 10 лептоспир/ мл). При замораживании спермы в среде с желтком куриного яйца чувствительность данного метода была низкой и позволяла выявить присутствие этих антигенов только в случае содержания 1000 лептоспир/мл.

Преимуществами заявленной среды над прототипом является повышение выживаемости сперматозоидов после замораживания и их оплодотворяющей способности, снижение вероятности заражения коров различными инфекционными заболеваниями при искусственном осеменении криоконсервированной спермой, а также повышение чувствительности метода ПЦР диагностики для выявления присутствия патогенных вирусов и микроорганизмов в криоконсервированной сперме быков.

Источники информации

1. Инструкция по организации и технологии работы станций и предприятий по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных. - М.: Колос, 1984, 159 С.

2. А.С. СССР №1189448 А. Бюл. №41, 1985.

3. Steinbach J, Foote R.J. Dairy Scince, 1964, v.47, p.812-815.

Изобретение относится к области ветеринарии. Среда включает трис-(гидроксиметил)-аминометан, фруктозу, лимонную кислоту, глицерин, воду и сухой соевый лецитин Центролекс Ф при следующем соотношении ингредиентов, мас.%: трис-(гидроксиметил)-аминометан - 2,65-2,85, фруктоза - 0,70-0,80, лимонная кислота - 1,3-1,5, глицерин- 5-7, сухой соевый лецитин Центролекс Ф - 8-12, вода дистиллированная - остальное. Среда позволяет снизить вероятность переноса различных инфекционных заболеваний при искусственном осеменении крупного рогатого скота, повысить криоустойчивость сперматозоидов и улучшить результативность осеменения коров. 3 табл.

Синтетическая среда для замораживания спермы быков, включающая трис-(гидроксиметил)-аминометан, фруктозу, лимонную кислоту, глицерин и воду, отличающаяся тем, что среда дополнительно содержит сухой соевый лецитин Центролекс Ф при следующем соотношении ингредиентов, мас.%:

Трис-(гидроксиметил)-аминометан2,65-2,85Фруктоза0,70-0,80Лимонная кислота1,3-1,5Глицерин5-7Сухой соевый лецитин Центролекс Ф8-12Вода дистиллированнаяостальное.