СПОСОБ НЕПРЕРЫВНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ В.В.ЯРОВЕНКО Российский патент 1995 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к биотехнологии, пищевой, медицинской и микробиологической отраслям промышленности, в частности к способам непрерывного культивирования микроорганизмов, например дрожжей для спиртового брожения, продуцентов, ферментов, антибиотиков.

Известны способы полунепрерывного и непрерывного культивирования дрожжей и бактерий, а также микроскопических грибов.

Известен способ непрерывного культивирования микроорганизмов с притоком свежей питательной среды и посевной культуры в головной ферментер бродильной батареи ферментеров и последовательном перемещении сбраживаемой среды [1]
Недостатком такого способа является низкая эффективность.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу является известный способ непрерывного культивирования микроорганизмов, предусматривающий приготовление посевной культуры, передачу ее и питательного сусла в головной ферментер батареи и последовательное перемещение культуральной среды в ферментерах непрерывно-проточным методом с притоком сусла, омолаживание клеточного состава среды с одновременным ингибированием путем передачи культуральной среды из первого головного ферментера во второй и из второго в последующий через 12-14 ч при достижении микроорганизмами экспоненциальной фазы физиологического развития, при этом отношение притока питательного сусла к посевной культуре составляет 1:9, причем удельную скорость роста микроорганизмов поддерживают равной 0,3-0,4 ч^-1 [2]
Недостатком известного способа является недостаточная эффективность использования батареи ферментеров, обусловленная невозможностью повторения цикла культивирования в батарее без остановки процесса во всех ферментерах.

Кроме того, в головных ферментерах батареи культуральная жидкость задерживается сверхнормативное время и подкисает, а в хвостовых проскакивает недостаточно выдержанная культуральная жидкость, не успевающая добродить. В результате этого повышается вероятность смешения старых клеток с молодыми и возможность инфицирования культуральной среды.

Отмеченные недостатки устраняются в предлагаемом способе непрерывного культивирования микроорганизмов, основанном на приготовлении посевной культуры и питательной среды, начальной загрузке их в головной ферментер батареи, состоящей из n предварительно простерилизованных ферментеров, получении ферментационной среды, последовательном ее перемещении из одного ферментера батареи в другой с обеспечением притока питательной среды и освобождении ферментеров от полученной культуральной жидкости по мере ее созревания, тем, что перемещение ферментационной среды из i-го ферментера (i 1,2,n) осуществляют последовательно в (i+1)-й, (i+k)-й ферментер, где 1 ≅k≅ n, интенсифицируют развитие микроорганизмов в ферментационной среде подачей питательной среды через i-й ферментер в k упомянутые ферментеры, переключают подачу питательной среды с i-го на (i+1)-й ферментер в момент заполнения объема (i+k)-го ферментера ферментационной средой, освобождают первый ферментер батареи от зрелой культуральной жидкости и стерилизуют его до момента заполнения n-го ферментера ферментационной средой и повторяют цикл культивирования микроорганизмов в батарее, причем каждый i-й ферментер батаpеи освобождают от зрелой культуральной жидкости и стерилизуют до момента заполнения ферментационной средой (i-1)-го ферментера, в каждом цикле культивирования микроорганизмов вводят посевную культуру одновременно с подачей питательной среды в j-й ферментер батареи, где 2<j<n, после его стерилизации, причем скорость притока питательной среды ν_п.ср в ферментеры задают в соответствии с условием
ν_п.ср где v объем одного ферментера;
t_созр время созревания культуральной жидкости в n/2 ферментерах батареи.

При этом скорость притока питательной среды увеличивают по мере увеличения удельной скорости μ размножения и развития микроорганизмов, а именно скорость притока питательной среды увеличивают в соответствии с условием
К(5 μ² + 0,1) ≅ν_п.ср.≅ К(7 μ² + 0,1), где К коэффициент пропорциональности.

На фиг. 1 приведена аппаратурно-технологическая схема, поясняющая предлагаемый способ культивирования микроорганизмов; на фиг. 2 а, б временные диаграммы, поясняющие принцип подачи питательной среды (ПС) в ферментеры батареи и переток ферментационной среды (ФС) из одного ферментера в другой; на фиг. 3 временная диаграмма, поясняющая последовательность освобождения от зрелой культуральной жидкости и стерилизации ферментеров батареи.

На временных диаграммах приняты следующие обозначения:
моменты времени t_i соответствуют переключению подачи ПС с (i-1)-го ферментера на i-й ферментер; количество верхних штрихов на t соответствует номеру цикла; загрузка посевной культуры (ПК) обозначена зачерненным квадратом и показана стрелкой;
направления вертикальных стрелок указывают взаимодействие i-го ферментера с (i+1)-м или n-го с первым ферментером и отражают моменты начала перетока ФС и переключения подачи ПС;
начало и продолжительность стерилизации ферментеров (СФ) отражены на фиг. 3 и обозначены прямоугольником с крестиком;
на вертикальной оси (фиг. 2 и 3) с левой стороны проставлены номера ферментеров от 1 до n-го.

Установка, реализующая предлагаемый способ, содержит батарею ферментеров I_i, где i + 1,2,n, маточник 2 емкость для приготовления (ПК) микроорганизмов, генератор 3 накопитель ПК и накопитель 4 ПС.

Маточник 2 связан с генератором-накопителем ПК 3, который соединен через трубопровод 5 и запорные вентили 6₁, 6_j с ферментерами 1₁ и 1_j (2 ≅j≅ n).

Накопитель ПС 4 соединен через трубопровод 7 и через запорные вентили 8₁ 8_n с каждым из ферментеров 1_i батареи.

Каждый предыдущий ферментер 1i батареи соединен с последующим 1_i+1 ферментером батареи через переточный трубопровод 9_i,i+1.

Все ферментеры 1_i батареи соединены через запорные вентили 10_i с выходным трубопроводом 11 для слива приготовленной культуральной жидкости (КЖ).

Сущность предлагаемого способа культивирования микроорганизмов состоит в том, что простерелизованные ферментеры батареи наполняют ферментационной (сбраживаемой) средой с молодыми клетками (гифами) культивируемых микроорганизмов, получаемых путем ввода ПС последовательно в каждый ферментер батареи через определенные промежутки времени с одновременной подачей молодой ферментационной среды из предыдущего ферментера, выполняющего функции микробогенератора. За один технологический цикл культивирования микроорганизмов в батарее каждый ферментер батареи от первого до n-го поочередно выполняет функцию микробогенератора и по мере образования молодых клеток культивируемых микроорганизмов передает ферментационную среду в очередной, становящийся головным, ферментер батареи, причем передача ФС осуществляется последовательно в k ферментеров (2 ≅k≅ n).

При последовательном продвижении вперед (по возрастанию номера i ферментера батареи) и ввода ФС в следующие простерилизованные и охлажденные ферментеры отключают предыдущий (i-1)-й ферментер, выполнявший функцию микробогенератора, и КЖ дозревает в нем с присутствующей в нем питательной средой.

Этот период (дозревания) характеризуется переходом стационарной фазы развития микроорганизмов в следующую фазу затухания, при достижении которой осуществляется освобождение данного ферментера от зрелой КЖ, его промывка, стерилизация и охлаждение.

Указанные операции повторяются циклически с каждым ферментером батареи.

Процесс происходит непрерывно, циклически и может длиться очень длительное время при условии выполнения требований стерилизации и соблюдения временных параметров при переключении подачи ПС в ферментеры, обеспечении необходимой скорости подачи ПС в зависимости от удельной скорости размножения микроорганизмов и времени созревания КЖ в ферментерах батареи.

Операции над материальным объектом (посевной культурой (ПК), ПС, ФС и КЖ) в предлагаемом способе осуществляются следующим образом.

Приготавливают ПК и ПС, которые находятся соответственно в маточнике 2 и накопителе 4 (фиг. 1). Из маточника 2 ПК перемещают в генератор-накопитель 3, где происходит размножение клеток и увеличение ее объема. ПО вместе с ПК в необходимом соотношении вводят в первый ферментер 1₁ батареи через трубопроводы 5 и 7 путем открытия запорных вентилей 8₁ и 6₁ и заполняют ферментер 1₁ примерно до 60% его объема. На временной диаграмме (фиг. 2) начало ввода ПС и ПК соответствует моменту t₁.

В первом ферментере образуется ФС и при достижении ее микроорганизмами экспоненциально-стационарной фазы развития и увеличении ее объема до заполнения ферментера 1₁ перемещают ее из ферментера 1₁ в ферментер 1₂ путем перетока через трубопровод 9_1,2 и далее в ферментер 1₃ при заполнении объема ферментера 1₂ (см. вертикальные стрелки на фиг. 2а).

В ферментеры 1₁ и 1₂ поступают молодые клетки микроорганизмов ФС, при этом ферментер 1₁ является биогенератором молодых клеток культуры для ферментеров 1₂ и 1₃ (в общем случае, для k ферментеров).

В момент времени t_i-1 (т.е. t₄, т.к. i 5) переключают подачу ПС с ферментера 1₁ на ферментер 1₂ путем закрытия вентиля 8₁ и открытия вентиля 8₂ и заполняют второй ферментер 1₂ до необходимого объема (см. фиг. 2б).

Во втором ферментере 8₂ при наличии ферментационной среды и ПС происходит размножение клеток культуры и рост ее объема. При достижении экспоненциально-стационарной фазы развития и заполнении объема ферментера 1₃ осуществляют перемещение ФС путем ее перетока через трубопровод 9_3,4 в четвертый ферментер 1₄. Начало перемещения ПС соответствует моменту времени t_i на фиг. 2.

Процесс в остальных ферментерах батареи осуществляется аналогичным образом.

В общем случае при достижении экспоненциально-стационарной фазы развития ФС в ферментере 1_i и заполнении его объема осуществляют перемещение молодой ФС путем ее перетока через трубопровод 9_i,i+1 в ферментер 1_i+1 и далее в ферментер 1_i+2 с переключением подачи ПС с i-го ферментера на (i+1)-й ферментер путем закрытия вентиля 8_i и открытия вентиля 8_i+1.

Таким образом, все ферментеры батареи последовательно осуществляют функции биогенераторов молодой культуры с передачей ее на последующие ферментеры.

В ферментерах, которые уже осуществили эту функцию, КЖ остается до ее полного созревания.

При заполнении последнего (n-го) ферментера I_n батареи осуществляют перемещение молодой ФС вновь в первый ферментер 1₁ (предварительно освобожденный от зрелой КЖ и свежепростерилизованный) и повторяют новый цикл культивирования в той же последовательности с обеспечением перетока ФС из i-го ферментера в (i+1)-й ферментер и переключением подачи ПС в моменты времени t_i.

Освобождение и стерилизацию ферментеров (СФ) от зрелой КЖ осуществляют в соответствии с временной диаграммой на фиг. 3, из которой видно, что стерилизация i-го ферментера должна закончиться непосредственно до момента t_i, который соответствует началу перетока ФС из (i-1)-го ферментера в i-й ферментер, т.е. ФС должна поступать в свежепростерилизованный ферментер 1_i.

В каждом цикле культивирования микроорганизмов осуществляют подпитку j-го ферментера 1_j батареи (2 ≅j≅ n) чистой посевной культурой из накопителя 3 ПК через трубопровод 5 и вентиль 6j в необходимой дозе. Это осуществляется периодически по мере заполнения j-го ферментера КЖ от предыдущего ферментера и ПС через вентиль 8_j, что способствует интенсификации процесса культивирования.

При этом скорость протока ПС ν_п.ср. в ферментеры 1_i батареи задают в соответствии с условием
ν_п.ср. ν_п.ср
Текущий i-й микробогенератор головной ферментер 1_i батареи, в который поступает молодая ФС и ПС как бы разделяет ферментеры батареи на две части ферментеры с номером N > i, в которых находится или будет находиться ФС с молодыми клетками, и ферментеры с номером N < i, в которых находится дозревающая КЖ.

По мере роста удельной скорости μ размножения и роста микроорганизмов скорость притока ПС ν_п.ср. увеличивают.

Степень увеличения скорости ν_п.ср. установлена экспериментально и должна удовлетворять условию
К(5 μ² + 0,1) ≅ν_п.ср.≅ К(7 μ² + 0,1).

Чем длиннее период размножения и роста клеток микроорганизмов, тем большее число ферментеров должно быть в батарее.

При высокой скорости размножения и роста культуры число ферментеров может быть сокращено до 3-х 4-х.

Предлагаемый способ был опробован в промышленных условиях для культивирования микробных клеток Asp.awamori.

Батарея содержала n 8 ферментеров, последовательно соединенных между собой посредством переточных труб с запирающими дисками с обеспечением поочередной подачи питательного сусла в очередной ферментер.

Эксперимент проводился при скорости подачи питательного сусла от 0,1 до 0,3 м³/ч. При этом производился замер концентрации клеток культуры в ФС, который составлял от 98 до 80 млн.кл/мл в зависимости от приведенной выше скорости притока питательного сусла.

Были определены оптимальные скорости притока ПС и перетока ФС из одного ферментера в другой.

Предлагаемый способ при внедрении его в спиртовую промышленность дает увеличение производительности в 1,3-1,4 раза по отношению к известным способам.

В пивоварении при испытании предложенного способа в производственных условиях увеличение производительности достигнуто в 2 раза.

В ацетоно-бутиловом производстве увеличение производительности достигнуто в 1,5 раза.

Использование: в биологической и пищевой отраслях промышленности. Сущность изобретения: способ основан на приготовлении посевной культуры и питательной среды, загрузке их в головной ферментер батареи, состоящей из n ферментеров, получении ферментационной среды и последовательном ее перемещении из i-го ферментера в (i + 1)-й, (i + k)-й ферментер (2 ≅ k ≅ n) при этом интенсифицируют развитие клеток в ферментере переключением притока среды с i го на (i + 1)-й ферментер, доводят культуральную жидкость (КЖ) до зрелости в j ферментерах (j < n), отключением от притока среды, при заполнении n-го ферментера средой и перемещением ее из n-го ферментера в первый ферментер батареи с предварительным освобождением его от зрелой культуры и повторяют цикл культивирования микроорганизмов, а каждый i-й ферментер батареи освобождают от зрелой КЖ и стерилизуют до заполнения (i 1)-го ферментера. 3 з. п. ф-лы, 3 ил.

1. Способ непрерывного культивирования микроорганизмов, основанный на приготовлении посевной культуры и питательной среды, начальной загрузке их в головной ферментер батареи, состоящей из n предварительно простерилизованных ферментеров, получении ферментационной среды, последовательном ее перемещении из одного ферментера в другой с обеспечением притока питательной среды и освобождением ферментеров от полученной культуральной жидкости по мере ее созревания, отличающийся тем, что перемещение ферментационной среды из i-го ферментера (i 1, 2, n), осуществляют последовательно в (i + 1), (i + к)-й ферментер, где 1 ≅ k ≅ n, интенсифицируют развитие микроорганизмов в ферментационной среде подачей питательной среды через i-й ферментер в упомянутые ферментеры, переключают подачу питательной среды с i-го на (i + 1)-й ферментер в момент заполнения объема (i + k)-го ферментера ферментационной средой, освобождают первый ферментер батареи от зрелой культуральной жидкости и стерилизуют его до момента заполнения n-го ферментера ферметационной средой и повторяют цикл культивирования микроорганизмов в батарее, причем каждый i-й ферментер батареи освобождают от зрелой культуральной жидкости и стерилизуют до момента заполнения ферментационной средой (i 1)-го ферментера. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в каждом цикле культивирования микроорганизмов вводят посевную культуру одновременно с подачей питательной среды в i-й ферментер батареи, где 2 < i < n, после его стерилизации. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что скорость притока питательной среды ν_п.с в ферментеры задают в соответствии с условием

где V объем одного ферментера;
t_созр время созревания культуральной жидкости в n/2 ферментерах батареи. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что скорость притока питательной среды в ферментеры задают в соответствии с условием
K(5μ²+0,1)≅ ν_п.ср≅ K(7μ²+0,1),
где K коэффициент пропорциональности;
μ удельная скорость размножения и роста клеток микроорганизмов.