ШТАММ BACILLUS THURINGIENSIS - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОТОКСИНА ПРОТИВ ЖЕСТКОКРЫЛЫХ НАСЕКОМЫХ И СПОСОБ ЕГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Российский патент 1998 года по МПК C12N1/20 A01N63/00 C12N1/20 C12R1/07 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к производству бактериальных средств защиты растений. Изобретение может быть использовано при получении биоинсектицида для борьбы с жесткокрылыми насекомыми - вредителями пасленовых культур, в частности для борьбы против колорадского жука.

Известен ряд веществ, применяемых против насекомых, поражающих сельскохозяйственные культуры, например химические инсектициды. Они эффективно уничтожают вредителей, но их действие, как правило, неспецифично. Кроме того, накапливаясь в окружающей среде, химические инсектициды создают неблагоприятную экологическую ситуацию.

Известен ряд препаратов биологической природы, обладающих высокой инсектицидной активностью, например "Битоксибацилин" [1], "Новодор" [2]. Инсектицидная активность "Битоксибациллина" определяется термостабильным экзотоксином, который поражает сравнительно широкий спектр насекомых, а также белковым эндотоксином, токсичным только для чешуекрылых. Благодаря высокой стабильности экзотоксин слабо разлагается в почве, в связи с чем существует опасность его аккумуляции в окружающей среде. Гораздо более высокой специфичностью в отношении воздействия на жесткокрылых насекомых отличается препарат, в котором содержится белковый эндотоксин (препарат "Новодор"). Действующее начало - эндотоксин - получают методом микробиологического синтеза путем культивирования Bacillus thuringiensis (BT). Процесс ферментации проводят на питательной среде, содержащей необходимые источники питания, при фиксированной температуре, в условиях аэрирования и перемешивания.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) к изобретению является способ с использованием штамма Bacillus thuringiensis supp, tenebrionis DSM 2803 [3], синтезирующего кристаллический белковый эндотоксин, обладающий летальным действием против колорадского жука. Однако по некоторым культуральным характеристикам - время ферментации, уровень спонтанной индукции фага и других - штамм-прототип DSM 2803 обладает рядом существенных недостатков.

Питательная среда для штамма-прототипа обладает рядом недостатков: содержащим большое количество дорогих компонентов, сложна в изготовлении и не может быть использована в крупнотоннажном производстве биопестицидов.

Цель изобретения - использование в качестве продуцента вновь полученного штамма Bac. thuringiensis (ВКПМ В-6649), активного против жесткокрылых насекомых, с улучшенными технологическими характеристиками, и способ его культивирования, отличающийся двухстадийностью и многократным применением в качестве компонента питательной среды фугата, полученного из культуральной жидкости. Наиболее близким техническим решением способа культивирования предложенного штамма является метод [4].

Предлагаемый способ получения эндотоксина осуществляют следующим образом.

Процесс микробиологического синтеза эндотоксина ведут с использованием штамма ВКМП В-6649, продуцирующего эндотоксин. Штамм культивируют в ферментере на питательной среде, содержащей необходимые компоненты. Через 18-20 ч. роста начинается спорообразование культуры. Показано, что для споруляции не требуется строго поддерживать параметры культивирования. Следовательно, можно перевести 30-95% культуральной жидкости (КЖ) в емкость, а оставшуюся в ферментере часть КЖ использовать в качестве посевного материала. Для приготовления новой питательной среды можно использовать фугат, оставшийся после центрифугирования КЖ от предыдущей ферментации. Предварительно простерилизованную новую ферментационную среду передают в ферментер с оставшимся в нем посевным материалом и начинают новый цикл культивирования. Таким образом, процесс биосинтеза эндотоксина осуществляется путем проведения последовательных циклов, каждый из которых включает две стадии. Для первой - активной стадии (рост культуры до начала споруляции) используется ферментер, а для второй - пассивной стадии (завершение споруляции культуры и образование кристаллов эндотоксина) применяется емкость без систем термостатирования и аэрирования.

Установлено, что таким образом можно провести 4 последовательных цикла без ущерба накоплению конечного продукта.

Таким образом можно повысить производительность ферментера, используемого для биосинтеза, при одновременном снижении удельного расхода воды на приготовление питательной среды и значительном уменьшении объема сточных вод при получении целевого продукта.

Предлагаемый штамм ВКПМ В-6649, продуцент эндотоксина против жесткокрылых, и способ его культирования иллюстрируется следующими характеристиками и примерами. Заявляемый штамм имеет следующие характеристики:
1. Культурально-морфологические признаки. Грамположительные подвижные палочки размером 1,4-1,8х2,6-3,2 мкм. Образуют споры и кристаллические включения в основном, квадратной и реже- ромбической формы. На агаризованных средах через 24 роста при 30^oC образует круглые с ровными краями колонии размером 5-6 мм с матовой поверхностью.

При культивировании в жидких питательных средах при аэрации штамм растет равномерно по всему объему.

При росте в богатых питательных средах - дрожже-полисахаридная среда (ДПС: кормовые дрожжи - 30 г/л, кукурузная мука - 15 г/л) споро- и кристаллообразование завершаются к 44-46 ч. культивирования при 28-34^oC. Титр термоустойчивых спор при культивировании в среде ДПС до 2,1 млрд. спор/мл, при росте в дрожжевой среде - 1,8-2,0 млрд. спор/мл. При культивировании на твердых и жидких питательных средах не наблюдается спонтанный выход фага.

2. Физиолого-биохимические признаки. Штамм ВТ ВКПМ В-6649 не сбраживает маннозу, салицин, эскулин; лецитиназу не образует; гидролизует крахмал; сахарозу сбраживают. Штамм усваивает ионы аммония и глутаминовую кислоту. Режим культивирования 28-34^oC, оптимум роста - 32^oC. Значения pH питательной среды для оптимального культивирования - 6,8-7,2. Штамм термостабильный экзотокин не синтезирует.

3. Генетические характеристики. В клетках штамма ВТ ВКПМ В-6649 содержатся экстрахромосомальные элементы (плазмиды) с молекулярными массами (в килобазах, кв): 60, 40 и 10. Генетические детерминанты токсинообразования локализованы на плазмиде с мол. весом 60 кв. Штамм устойчив к полимиксину - 100 мкг/мл. Кристаллы штамма состоят из белков с молекулярными массами - 40, 73, 68 и 65 кDa (возможно, два последних белка являются продуктами распада белка 73 кDa).

4. Инсектицидные свойства. Штамм высоко активен против жесткокрылых насекомых, в частности против колорадского жука. Инсектицидная активность связана с кристаллическим белковым эндотоксином. Молекулярная масса белкового токсина составляет 73 кDa. Эффективность штамма определялась в лабораторных условиях на личинках колорадского жука I-II возраста.

5. Способ получения штамма. Штамм выделен из природной среды (из мертвой озимой совки) методом ацетатной селекции. Селекция штамма велась по следующим признакам: время спорообразования, фагоносительство, токсичность.

Пример 1. Сравнительные биоиспытания штаммов ВТ в лабораторных условиях.

Для сравнительной оценки проведены лабораторные испытания токсичности штамма ВТ ВКПМ В-6649 и прототипа DSM 2803 на личинках колорадского жука. Штамм культивировали в стандартных условиях (дрожже-полисахаридная среда, 60 ч. роста, аэрация, 28-32^oC). Листья картофеля одинакового размера замачивали в бюксах с различными разведениями культуральной жидкости обоих штаммов. После подсушивания листья, черенок которых был обернут влажной ватой (чтобы лист не подсыхал), переносили в чашки Петри и кисточкой помещали по 10 личинок колорадского жука I-II возраста. Каждое разведение испытывали в 3 повторностях. Чашки инкубировали при комнатной температуре 3 дня на свету. Результаты предоставлены в таблице.

Пример 2. Определение концентрации токсического белка ВТ, активного против жесткокрылых насекомых, методом иммуноферментного анализа (ИФА).

Метод основан на избирательном связывании токсичного белка ВТ поликлональными антителами (АТ), полученными из кроличьих антисывороток к очищенному белку и иммобилизованными на пластиковой основе. Комплекс антиген-антитело окрашивается в результате реакции пероксидазы с o-фенилендиамином с образованием цветного комплекса, по оптической плотности которого определяют концентрацию белка в испытуемых образцах (по сравнению со стандартными растворами антигена - от 2 мг до 2 нг с кратностью 10) [5].

Пробу КЖ объемом 1 мл центрифугировали на центрифуге "Эппендорф" в течение 10 мин при комнатной температуре. Осадок растворяли тем же количеством 0,5 н. NaOH, тщательно размешивали и выдерживали при комнатной температуре 1 ч. Далее центрифугировали 10 мин и работали с надосадком.

Поликлональные АТ (с известной заранее концентрацией) разводили в боратном буфере до 5 мкг/мл и ими заполняли плоскодонный планшет 12-канальными пипетманом по 50 мкл, закрывали крышкой и инкубировали 4 ч. при комнатной температуре или ночь в холодильнике. Отмывали в водопроводной воде 5 раз и добавляли по 100 мл 1% раствор БСА в боратном буфере, инкубировали 2 ч. при комнатной температуре, отмывали водопроводной водой 5 раз. Образцы и разводки стандартного антигена (2 нг, 20 нг, 200 нг, 2 мкг, 20 мкг, 200 мкг, 2 мг) наносили в 2 повторах на планшет по 50 мкл и добавляли туда же такое же количество АТ (концентрация 250 нг/мл). Инкубировали 1 ч. при 37^oC, отмывали 5 раз водопроводной водой и производили скрашивание свежеприготовленным раствором o-фенилендиамина в фосфатно-цитратном буфере с добавлением перекиси водорода (4 мг o-фенилендиамина, 10 мл буфера, 4 мкл H₂O₂) по 100 мкл. В течение нескольких минут происходило окрашивание бесцветного комплекса АГ/АТ в желто-коричневый цвет, который фиксировали добавлением 10% H₂SO₄. Измерение оптической плотности проводили на мультискане при 492 нм.

По калибровочной кривой определяли содержание токсического белка ВТ в мг/мл.

Содержание целевого токсина в последующих примерах и циклах определяли методом ИФА.

Пример 3. Культивирование штамма.

Для культивирования штамма-продуцента использовали ферментер вместимостью 1,2 л. Ферментационную среду готовили, используя водопроводную воду. Компоненты среды брали в расчете на 0,8 л среды.

Состав среды, г/л:
Кормовые дрожжи (ВВК) - 15
Хлористый кальций - 0,5
Пропинол Б400 - 1,0
Вода - Остальное
Величина pH среды перед стерилизацией составляла 6,.8-7,2. Среду стерилизовали в автоклаве при давлении 0,8 МПа в течение 45 мин. После стерилизации среду охлаждали до 30-35^oC. Засев среды производили в асептических условиях при помощи стерильной петли. Объем посевного материала составлял 1% объема питательной среды. Затем среду загружали в простерилизованный ферментер (ферментер стерилизовали при тех же условиях, что и ферментационную среду) через посевную колбу. Процесс ферментации - активная стадия - вели при следующих условиях:
Температура - 33+1^oC
Скорость вращения мешалки - 500 об/мин
Расход воздуха - 0,8 л/мин
pH - статирование - Нет
Через 26-30 ч. роста КЖ через пробоотборник сливали в емкость. При этом в ферментере оставляли КЖ, которая служила в качестве посевного материала для следующего цикла. Выдержка в емкости - пассивная стадия велась в течение 24 ч. при комнатной температуре. Содержание белка в КЖ составляло 2,0 г/л. Далее КЖ центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 мин. Полученную пасту использовали для приготовления конечного продукта, а фугат - для приготовления новой питательной среды.

Пример 4. Использование КЖ в качестве посевного материала.

Данный пример аналогичен предыдущему, за исключением того, что в качестве посевного материала использовали КЖ, которая была оставлена в ферментере в предыдущем цикле, при этом ферментер повторно не стерилизовали. Оптимальным количеством оставляемой КЖ являлось 5-10% от начального объема.

Пример 5. Использование фугата для приготовления новой питательной среды.

Данный пример аналогичен предыдущему, за исключением того, что для приготовления питательной среды использовали полученный ранее фугат. Если количество фугата недостаточно для проведения нужного объема среды, тогда объем доводили водопроводной водой. Показано, что при однократном использовании фугата в КЖ накапливалось не менее 2,0 г/л белка.

Пример 6. Способ ферментации.

Ферментация состояла из 4 циклов. Компоненты питательной среды, условия стерилизации и культивирования (активной и пассивной стадии), центрифугирования одинаковы для всех циклов.

Для культивирования продуцента использовали ферментер объемом 1,2 л. Компоненты среды брались в расчете на объем среды 0,8 л.

Состав среды, г/л
Кормовые дрожжи (БВК) - 15
Хлористый кальций - 0,5
Пропинол Б400 - 1,0
Посевной материал выращивали в пробирке на качалке в течение 8-12 ч. при температуре 30-33^oC. Состав среды для посевного материала аналогичен ферментационной среде.

1-й цикл. Среду готовили на водопроводной воде, pH доводили до 6,8-7,2 40% раствором NaOH. Ферментационную среду и ферментер стерилизовали в автоклаве при давлении 0,8 МПа в течение 45 мин.

Простерилизованную ферментационную среду охлаждали до температуры 30-45^oC и после этого в асептических условиях при помощи стерильной пипетки засевали посевным материалом в количестве 1,0% от объема среды. Затем среду в асептических условиях через посевную колбу заливали в ферментер. Процесс вели при следующих условиях:
Температура - 33+1^oC
Скорость вращения мешалки - 500 об/мин
Расход воздуха - 0,8 л/мин
pH-статирование - Нет
После 26-30 ч. роста КЖ сливали в емкость, при этом в ферментере оставляли приблизительно 5-10% КЖ в качестве посевного материала для следующего цикла. Слитую КЖ выдерживали в емкости при температуре окружающей среды. После выдерживания КЖ содержала 2,0 г/л белка эндотоксина. Далее КЖ центрифугировали при 6000 об/мин в течении 30 мин. Полученную пасту направляли на дальнейшую обработку, а фугат использовали для приготовления питательной среды 3-го цикла.

2-й цикл. После того как КЖ от 1-го цикла слили из ферментера в емкость, в ферментер в асептических условиях заливали свежую простерилизованную питательную среду, приготовленную на водопроводной воде. При этом ферментер заново не стерилизовали, а в качестве посевного материала использовали КЖ, оставленную в ферментере от 1-го цикла. Культивирование в ферментере велось в течение 26-30 ч. , после чего КЖ сливали в емкость, оставляя в ферментере 5-10% КЖ в качестве посевного материала для следующего цикла. После выдерживания содержание белка в КЖ - 2,0 г/л. Затем КЖ центрифугировали, полученную пасту направляли на дальнейшую обработку, а фугат использовали на приготовления питательной среды 4-го цикла.

3-й цикл. Ферментационную среду готовили, используя фугат, полученный в 1-й цикле. Простерилизованную среду в асептических условиях заливали в ферментер после его освобождения от КЖ 2-го цикла. Культивирование в ферментере велось в течение 26-30 ч. , после чего КЖ сливали в емкость, оставляли в ферментере 5-10% КЖ. После выдерживания содержания белка в КЖ 2,0 г/л. КЖ центрифугировали, полученную пасту направляли на дальнейшую обработку, а фугат сливали в канализацию.

4-й цикл. Ферментационную среду готовили, используя фугат, полученный во 2-м цикле. Простерилизованную среду в асептических условиях заливали в ферментер после его освобождения от КЖ 3-го цикла. Культивирование в ферметере велось в течение 26-30 ч., после чего КЖ сливали в емкость. После выдерживания содержание белка в КЖ - 2,0 г/л. Далее КЖ центрифугировали, полученную пасту направляли на дальнейшую обработку, а фугат сливали в канализацию.

Как видно из приведенных примеров, предложенный способ культивирования позволял провести не менее четырех последовательных циклов биосинтеза без ущерба уровню накопления эндотоксина в КЖ. Уровень накопления эндотоксина в КЖ на стадии выдерживания в емкости не уступали содержанию эндотоксина, достигаемому при культивировании продуцента в ферментере в течение всей ферментации (без выдерживания). Наконец можно, по крайней мере один раз, использовать фугат для повторного приготовления ферментационной среды.

Сравним производительность предлагаемого способа культивирования с изложенным в прототипе. Для определения примем, что время подготовки и стерилизации пустого ферментера составляло не менее 3 ч., время выгрузки КЖ и загрузки новой ферментационной среды - 3 ч. Тогда время 1-го цикла составило суммарно 3+3+30=36 ч., продолжительность каждого последующего цикла - 3+30= 33 ч. Общая продолжительность четырех циклов составляла 36+33•3=135 ч. Если принять полный объем КЖ в ферментере за 100% и учесть, что от первых трех циклов в ферментере в качестве посевного материала оставалось каждый раз по 5-10% КЖ, суммарный съем КЖ с ферментера за 4 цикла составил 90•3+100=370% сут. Производительность процесса составляет 370%/сут/135 ч.•24 ч=65,7%/сут. Аналогичная величина, рассчитанная для прототипа, в лучшем варианте (48 ч. культивирования) составляла 100%/сут/(3+3+48)•24=44,5%/сут. Таким образом, производительность предлагаемого способа культивирования повышается на 20%.

Оценим снижение удельного расхода воды на приготовление питательной среды. Примем расход воды на приготовление ферментационной среды для первого цикла ферментации равным 100%. Для второго цикла используется фугат, полученный при обработке 90% КЖ. Если принять во внимание, что выход фугата равен примерно 0,9 от обработанной КЖ, то его количество составит примерно 80%. Это означает, что при приготовлении среды для следующего цикла ферментации будет израсходовано дополнительно только 20% воды; на два цикла - 120%. Следовательно, удельный расход воды в расчете на 1 цикл составит 120% : 2= 60%, т. е. на 40% ниже, чем в прототипе. Соответственно снижается удельный объем сточных вод.

Проведенный анализ показывает, что предложенный способ получения эндотоксина позволяет достичь поставленную цель - повысить производительность ферментеров при проведении процесса биосинтеза эндотоксина и снизить удельный расход воды на приготовление ферментационной среды.

Источники информации
1. Кандыбин Н.В. с соавт. Новые экзотоксигенные штаммы Bacillus thuringiensis. В сб.: Бактериальные средства и методы борьбы с вредными насекомыми и грызунами. - Л.: Колос, 1972, с.20-23.

2. Rugh S. Use of a Coleopteran active Bacillus thuringiensis for controlling the cereal leaf beetke Oulema melanopa. WO 91/14369.

3. Krieg V. A. at al. Bacillus thuringiensis var. tenebrionis: a new pathotype effective against larvae of Coleoptera. Z. Ang. Entomol., 1983, 96:500-508.

4. Быков В. А. , Крылов И.А., Манаков М.Н. с соавт. Микробиологическое производство биологически активных веществ и препаратов. -М.: Высшая школа, 1987, с.66-72.

5. Дубейковская З. А. , Франк Р.И. с соавт. Количественное определение белка энтомоцидных кристаллов Bac. thuringiensis с помощью иммунохимических методов. - "Биотехнология", 1990, 5, с.89-92.2

Изобретение относится к микробиологической промышленности, к производству бактериальных средств защиты растений, в частности биоинсектицида для борьбы с жесткокрылыми насекомыми. Из природной среды выделен штамм бактерий Bacillus thuringiensis - продуцент эндотоксина против жесткокрылых насекомых, в частности, для борьбы с колорадским жуком. Штамму присвоен номер 16931. Данный штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером В-6649. При воздействии разведенной в 10 раз культуральной жидкостью данного штамма на личинки колорадского жука I - II возраста наблюдается 100% гибель. Для получения эндотоксина готовят питательную среду, засевают ее штаммом, культивируют в ферментере до начала споруляции, затем полученную культуральную жидкость отбирают в количестве 90 - 95% от объема, дображивают при комнатной температуре, затем центрифугируют, получая при этом фугат и пасту, из которой готовят конечный продукт. Фугат направляют на приготовление новой питательной среды, а сотавшуюся часть культуральной жидкости в ферментере используют в качестве посевного материала. 2 с.п.ф-лы, 1 табл.

1. Штамм Bacillus thuringiensis ВКПМ В-6649 - продуцент эндотоксина против жесткокрылых насекомых. 2. Способ культивирования продуцента эндотоксина против жесткокрылых насекомых, предусматривающий приготовление питательной среды, засев среды продуцентом эндотоксина, культивирование его в ферментере, отбор культуральной жидкости в емкость с последующим центрифугированием ее и получением фугата и целевого продукта и направлением фугата на стадию приготовления среды, отличающийся тем, что культивирование продуцента в ферментере осуществляют до начала споруляции, культуральную жидкость в емкость отбирают в количестве 90 - 95% от объема, дображивают ее при комнатной температуре, а оставшуюся часть культуральной жидкости используют в качестве посевного материала на следующей стадии культивирования.