Термотолерантный штамм дрожжей @ @ @ @ ,используемый для сбраживания крахмалсодержащего сырья при производстве этилового спирта и способ сбраживания крахмалсодержащего сырья при производстве этилового спирта Советский патент 1984 года по МПК C12N15/00 C12P7/06 

Изобретение относится к спиртовой промьшшенности и представляет собой термотолерантный штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса ВП для сбраживания крахмалсодержащего сырья в спиртовой отрасли и способ сбраживания крахмалсодержащего сырья.

Известен термотолерантный штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae рас К-81, используемый для обслуживания крахмалсодержащего сырья при производстве спирта l} .

Недостатком этого штамма является его неспособность сбраживать высококонцентрированное сусло (17-19% СВ).

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является штамм Saccharomyces cerevisiae раса ХП, сбраживающий высококонцентрированное сусло 2 .

Недостатком известного штамма является то, что он не термотолерантньй и уже при температуре выше 32. С происходит автолиз, что ведет к инфицированию среды посторонними микро организмами и к потерям спирта.

Известны способы сбраживания крахмалсодержащего сырья при производстве спирта, предусматривающие введение дрожжей и сбраживание зерно-кар.тофельного сусла непрерывно-поточным методом 3j .

Наиболее близким тех гическим решением к предлагаемому является способ сбраживания крахмалсодержащего сырья при производстве этилового спирта, предусматривающий приготовление посевной культуры, подготовку питательной среды путем смешивания крахмалсодержащего сырья с необходимыми для дрожжей солями - карбамидом и диаммонийфосфатом, дрожжегенерацию осахаривание и передачу дрожжевой культуры и сусла концентрацией 1719% СВ в головной ферментер батареи с последовательным перемещением непррывно-поточным методом и притоком осхаренного сусла 4j .

Недостатком известного способа является то, что процесс брожения протекает при температуре не вьшзе , при повышении же температуры происходит значительный автолиз дрожжевых клеток и инфицирование среды. Так как нарушается в процессе брожекия оптимальное сбалансированное питание по азоту и углеводам, дрожжи теряют свою активность, что в сочетании с инфицированием среды приводит к значительным потерям в выходе спирта. Уже после 48 ч сбраживания нет резервов для удлинения процесса и получения дополнительного выхода спирта. Наступает инфицирование среды и потеря дрожжами бродильной активности.

Целью изобретения является получение термотолерантного штамма дрожжей, способного сбраживать высококонцентрированное сусло при повьщ1енных температурах, обеспечение стерильности процесса, ускорение процесса сбраживания путем поддержания постоянным оптимального для размножения дрожжей соотношения азота к сбраживаемым углеводам.

Предлагаемый штамм выделен из производственных дрожжей и адаптирован к высоким концентрациям сухих веществ в сусле.

Селекция проводилась в два этапа. Первый этап заключался в вьщелении расы дрожжей из производства, способной сбраживать сырье при повьш1енной температуре (34-36 С). Для этого применяемая на заводе культура дрожжей рассеивалась в виде колоний на суслоагар и выращивалась при 34-36°С. Колонии, отличающиеся от исходной расы дрожжей, проверялись на способность сбраживать углеводы.

На втором этапе селекции был применен метод адаптации термотолерантной расы к высоким концентрациям сухих веществ. Путем еженедельного пересева термотоларантной расыиз среды с повьшгенной концентрацией сухих веществ и рассева дрожжей в виде колоний на сусло-агар была отобрана раса, отличительной чертой которой была способность при 34-36 С сбраживать сусло с высокой концентрацией сухих веществ (до 20%).

Штамм хранится в коллекции музея культур промышленных микроорганизмов Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции, коллекционный номер У-408.

Предлагаемый штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса ВП имеет следующие морфологические и культуральные признаки.

Морфологические признаки. Дрожжевые клетки овальной или яйцевидной формы. Размер клеток 7,5x5,9 мкм Размножение почкованием. Форма дрожжевых клеток, выращенных на суслоагаре в течение 26-28 ч при 32-34 С, яйцевидная, овальная, редко встречаются клетки вытянутой формы.

Гигантская колония 10-суточной j культуры на сусло-агаре. Форма колонии: круглая. Размер колонии: 26-28 мм в диаметре. Характер края: крупнолопастной с радиальной исч рченностьюJO Поверхность: тусклая. В центре колонии выпуклый валик неправильной формы с морщинистой поверхностью.

Цвет колонии: белый с кремоватой се- 15 рединой. Профиль колонии: в центре выпуклый.

Штрих на сусло-агаре. Рост: мощный, плотный.

арактер края: мелкофестончатый. 20 Профиль: выпукльй. Цвет, штриха - тусклобелый.

Рост по уходу в сусло-агар. Рост по длине укола, утолщающийся кверху. .25

Форма укола: бугристая. Разжижения не наблюдается. Питательная среда пронизана пузырьками газа.

Физиологические признаки. зо Оптимум температуры роста 34/36 С.

Отношение к источникам углерода. Усваивает глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу. Слабо ассимилирует ксилозу, арабинозу. Не усваивает мал, декстрины, мелибиозу.

Отношение к источникам азота. Хорошо ассимилирует мочевину, пептон, дрожжевой автолизат, азотнокислый и хлористый аммоний, азотнокислый ка- 0 ЛИЙ, кальций, нат1)ий. Не потребляет сернокисльш аммоний. Факультативный анаэроб.

Для достижения поставленной цели по способу сбраживания крахмалсодер- 5 жащего сырья при производстве этилового спирта, предусматривающему приготовление посевной культуры, подготовку питательной среды путем смешивания крахмалсодержащего сырья с не- 50 обходимыми для дрожжей солями - карбамидом и диаммонийфосфатом, дрожжегенерацию, осахаривание и передачу дрожжевой культуры и сусла концентрацией 17-19% сухих веществ в голов- 55 ной ферментер батареи с последовательным перемещением непрерывно-поточным методом и притоком осахаренного сусла, в качестве посевной культуры используют термотолерантный штамм дрожжей Saccharomyfees cerevisiae раса ВП, а в процессе дрожжегенерации осуществляют адаптацию этого штамма к уело-. ВИЯМ сбраживания путем трехступенчатого пересева его на осахаренное сусло концентрацией 17-19% сухих веществ с постепенным повьш1ением температуры от 22 до 28°С, от 28 до 30°С и от 30 до 32 С, при этом карбамид разделяют на две части в соотношении 1:4, большую из которых вводят в осахаренное сусло перед первой ступенью пере сева, а меньшую - на лаг-фазу процесса брожения совместно с притоком осахаренного сусла.

Предлагаемьш способ осуществляется следующим, способом.

Культуру Saccharomyces cerevisiae раса ВП выращивают на сусло-агаре в пробирках, хранят культуру, затем пересевают на свежую питательную среду - сусло-агар.

Затем осуществляют разведение чистой культуры путем ее последовательного пересева.

Полученные засевные дрожжи адаптируют к повьш енной температуре сбраживания, осуществляя последовательный пересев в три ступени на осахаренное высококонцентрированное tycno с постепенным повьш1ением температуры от 22 до 28°С, от 28 до и от 30 до 32°С.

Карбамид разделяют на две части в соотношении 1:4 и вводят соответственно в осахаренное сусло перед первой ступенью адаптации и на лагфазу в процессе брожения совместно с притоком дрожжей и осахаренного сусла.

Соотношение усвояемого азота к сбраживаемым углеводам на протяжении всего процесса брожения поддерживают равным 1:200.

Брожение ведут непрерывно-поточным методом.

;v

Пример 1. Культуру Sacch. erevisiae раса ВП вьфащивают на усло-агаре с содержанием 7% СВ в робирках при 32 С в течение 24 ч. ранят культуру при в течение ,5 мес. По истечении указанного рока для сохранения бродильной акивности культуру пересеивают на вежую питательную среду - сусло-агар.

511

Затем осуществляют разведение .чистой культуры путем последовательного пересева из пробирки с культурой в колбу, содержащую 0,5 л стерильного сусла. Сусло приготавливается из измельченного солода (на 1 кг солода расходуется 0,7 л воды), осахаривается при 58 С в течение 2 ч. Концентрация его должна составлять 12° по сахарометру,

Колбу с суслом и дрожжами помещают в термостат при , Через 20 ч бродящее дрожжевое сусло переливают ;в бутыль с 5 л стерильного такого же сусла, подкисленного до 0,8д. Бутыль с суслом помещают в термостат 30 С при отброде, равном 5 по сахарометру, переливают содержимое в маточник с 5 дал сусла концентрацией 10 по сахарометру, подкисленное до OjE,

Для разведения дрожжей в маточнике используют нефильтрованное сусло, приготовленное следующим образом.

Для приготовления 1 дал дрожжевого сусла расходуется 1,3 кг ржаной . муки и 1,9 кг измельченного зеленого солода. Муку смешивают с водой при 30°С. Смесь выдерживают при в течение часа, расхолаживают до 60С после чего заливается дробленый солод. Осзхаривание продолжается 1 ч при 58°С и 1,5 ч при 65 С. Затем сусло вцп.ерживается при 80 С в течение 30 мин, охлаждается до 50 С и подкисляется до 0,75° -серной кислотой. .

Засевные дрожжи из бутыли в маточник задаются в объеме 10% при 30 С. :Из маточника дрожжи передают для последующего размножения в дрожжанки.

Характеристика зрелых дрожжей представлена в табл. 1, динамика накопления дрожжевых клеток - в табл. 2.

Пример 2, Полученные по г примеру 1 засевные дрожжи адаптируют к повышенной температуре сбраживаиия, осуществляя пересев в три стуiieini на сусло, приготовленное из из.мельченной пшеницы. Для получения сусла пшеницу измельчают, смешивают с- водой гз соотношении 1:2,8 до концентрации 18% СВ, осахаривают смесью солодов в течение 2 ч.

В осахаренное сусло задают диаммоиипфосфат в ко;п1честве 150 г и карбамид п количестве 560 г на 1 м/сусла, поромешивают, пастеризуют в течение 20 мин при 80 С, подкисляют до рН 3,6-3,8, охлаждают до температуры

19

1-й стадии адаптации 22-С, засевают на эту среду дрожжи в количестве 10/: к объему осахаренного сусла и сбраживают в течение 18 ч, поддерживая температуру брожения до 28 С. Затем вновь аналогичным образом готовят сусло, вводят дрожжи в количестве . 10% к объему сусла и сбраживают в течение 16 ч , поддерживая температуру 28-30°С (за счет тепла, выделяемого при сбраживании). Аналогично осуществляют 3-ю стадию адаптации в течение 16 ч, поддерживая температуру 30-32 С

Отношение азота к углеводам устанавливают оптимальным для дрожжей, равным 1:200, при введении карбамида на стадии дрожжегенерации.

С 3-ей стадии адаптированные к производственным условиям дрожжи пересевают в три дрожжанки на сусло, приготовленное указанным способом.

Через 14 ч сбраживания производственные дрожжи из 3-х дрожжанок передают в головной ферментер батареи. Сбраживание осуществляют в ферментере емкостью 100 м при скорости притока сусла 12 м в час и подачи дрожжей - 30 м совместно с карбамидом, .который задают в количестве 140 г на 1 м сусла для поддержания соотношения азота к сбраживаемым углеводам равным, как уже доказьшалось, 1:200 Температура подаваемого сусла на брожение 30 С. Брожение ведут непрерывно-поточным методом в течение 60 ч при температуре на стадии главного брожения до 38°С. Выход спирта равен 65,5 дал из 1 т крахмала.

Технологические показатели зрелой бражки представлены в табл. 3.

Осуществление процесса достигается использованием термотолерантного штамма дрожжей и введением карбамида в два приема - на стадии дрожжегенерации и в начальной стадии процесса брожения. I

При использовании термотолерантного штамма сохраняется жизнедеятельность дрожжей при высоких температурах. В этом случае не происходит значительный автолиз дрожжевых клеток, сохраняется их бродильная активность и тем самым ингибируется развитие посторонней микрофлоры.

Этот эффект, направленный на сохранение жизнедеятельности и высокой активности дрожжей, еш.е более усиливается введением и поддержанием сба1117

лансированного питания по азоту и yi- леводам. Азот необходим для создания белков,дрожжевой клетки, включая структурные белки, входящие в состав оболочки клетки, оболочки спор, и 5 структурные элементы внутренних частиц клетки, и для создания всей ферментной системы клетки.

Углеводы необходимы для дыхания клетки, биосинтеза белков в тех слу- fO чаях, когда нет необходимых аминокислот.

Из карбамида дрожжей образуют один из необходимых для их развития витаминов - биотин.15

Максимально возможная скорость размножения дрожжей достигается лишь при обязательной и строгой сбалансированности процессов анаболизма и катаболизма. Скорость размножения дрожжей на 20 богатых питательных средах в значительной степени зависит от сбалансированного источника питания.

Внутриклеточная концентрация азо тистыхи углеводных соединений возрас- 25 тает в лаг-период весьма существенно, поэтому важно ввести источник азота именно в две фазы на стадии активного размножения дрожжей и в период лаг-фазы, когда молодые клетки уже . Q потребили часть питательных веществ и его надо восполнить, чтобы соотноКонтроль

19 . 8 шение азота к углеводу было постоянным и равным 1:200.

После лаг-фйзы жизнедеятельность дрожжей протекает в постоянных установившихся условиях, начинается процесс биосинтеза спирта и это соотношение уже остается постоянным.

Если давать карбамид лишь на стадии дрожжегенерации, Td это приведет к увеличению в среде источника азота и энергии при отсутствии сбалансированности по углеводу, что отрицательно влияет на физиологическое состояние клетки. Оптимальным является соотношение 1:200, так как выше или ниже этих пределов неиспользованная на процессы размножения клеток энергия рассеивается в виде тепла и аккумулируется в запасных и недоокисленных продуктах метаболизма.

Преимущества предлагаемого технического решения по сравнению с, известным представлены в табл. А.

Таким образом, предлагаемые штамм и способ позволяют сбраживать высококонцентрированное сусло при повышенных температурах, обеспечить стерильность процесса, ускорить процесс сбраживания путем поддержания постоянным соотношения азота к сбраживаемым углеводам.

Таблица 1

1. Термотолерантный штамм дрожжей Saccharorayces cerevisiae раса ВП (коллекция культур промьшшенных микроорганизмов Всесоюзного научноисследовательского института генетики и селекции микроорганизмов, коллекционный номер ЦМПМ У-408), используемый для сбраживания крахмалсодержащего сырья при производстве этилового спирта. 2. Способ сбраживания крахмалсодержащего сырья при производстве этилового спирта, предусматривающий приготовление посевной культуры, подготовку питательной среды путем смешивания крахмалсодержащего сьфья с необходимыми для дрожжей солями - карбамидом и диаммонийфосфатом, дрожжегенерацию, осахаривание и передачу дрожжевой культуры из сусла концентрацией 17-19% сухих веществ в.головной ферментер батареи с последовательным перемещением непрерьшно-поточным методом и притоком осахаренного сусла, (Л отличающийся тем, что, с целью обеспечения стерильности процесса, ускорения процесса сбражива§ ния путем поддержания постоянным оптимального для размножения дрожжей соотношения азота к сбраживаемым yi- леводам, в качестве посевной культуры используют термотолерантный штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса ВП, в процессе дрожжегенерации осу ществляют адаптацию этого штамма к со условиям сбраживания путем трехступенчатого пересева его на осахаренсо ное сусло концентрацией 17-19% сухих веществ с постепенным повьш1ением температуры от 22 до 28с, от 28 до , от 30 до 32 С, при этом карбамид разделяют на две части в соотношении 1:4, большую из которых вводят в осахаренное сусло перед первой ступенью пересева, а меньшую - на Лаг-фазу процесса брожения совместно с притоком осахаренного сусла.

Средние результаты 27 22 11,0 19.6 28,5 19.7 0,0 0,8 0,4 0,4

10

1117319 Продолжение табл. 1

13

Процесс протекает при температуре не вьппе Повышение температуры приводит к инфицированию, так как дрожжи не термотолерантны и подвергаются автолизу Примечание. так как идет нарастание ния выхода.

14 Таблица

1117319

64,7 дал/т

48 ч крахмала Дальнейшее увеличение времени сбраживания невозможно, кислотности и потеря спирта. Нет резервов для увеличе