ФИБРИН-ИЗОПЕПТИДАЗА Российский патент 1995 года по МПК C12N9/48 C12N9/64 

Изобретение относится к новому нативному ферменту, выделенному из медицинской пиявки Hirudomedicinalis, фибрин-изопептидазе. Фермент обладает способностью гидролизовать изопептидные связи в стабилизированном фибрине, что позволяет предполагать возможность его использования в медицине для лечения застарелых тромбозов и тромбоэмболических состояний.

Известно, что структурной основой тромбов в крови млекопитающих является стабилизированный фибрин. Он образуется на последних стадиях процесса свертывания крови под действием специфической трансглутаминазы фактра XIIIа в присутствии ионов Са²⁺ за счет возникновения поперечных сшивок (кросс-линкингов) между полипептидными цепями фибрина, которые представляют собой изопептидные связи между ζ-NH₂-группой лизина и γ-СООН-группой глутамина.

В настоящее время известно значительное число фибринолитических ферментов, выделенных из различных природных источников: грибов, бактерий, моллюсков, земляных червей, змеиного яда, желчи и вакуляризованной соединительной ткани млекопитающих и т.п. Все они являются пептидазами. Биологическое действие одной части фибринолитических ферментов направлено на то, чтобы активизировать природный путь фибринолиза, т.е. повлиять на переход плазминогена в плазмин. Другую группу фибринолитических ферментов составляют пептидазы, способные расщеплять фибрин. К ним относятся, например, фермент гементин, выделенный из секрета слюнных желез гигантской амазонской пиявки Haementeria ghilianii [1]
Однако в случае сформировавшихся тромбов ферментативное расщепление пептидных связей фибрина под действием фибринолитических пептидаз происходит прежде всего на поверхности тромба и в местах его прикрепления к стенкам сосуда, что может приводить к отщеплению от тромба крупных фрагментов и этим способствовать возникновению тромбоэмболических состояний.

На сегодняшний день известен единственный ферментный препарат дестабилаза, выделенный из секрета слюнных желез медицинской пиявки Hirudo medicinalis, который обладает способностью гидролизовать изопептидные связи в стабилизированном фибрине [2]
Очевидно, что такой механизм должен приводить к нарушению жесткой структуры фибрина и его крупных фрагментов при сохранении целостности полипептидных цепей, что будет способствовать постепенному разрыхлению тромба и его переходу в растворимое состояние.

Предлагаемый нативный фермент фибрин-изопептидаза, выделенный из медицинской пиявки Hirudo medicinalis, обладает изопептидазной и амидолитической активностью и имеет следующие характеристики: мол. мас. 15000±1000 Д; изоэлектрическая точка 7,3±0,1; субстратная специфичность: фермент гидролизует γ-Glu-ζ-Lys-изопептидные связи в продукте ограниченного протеолиза фибрина-димере его D-фрагмента при pH 8,0 и амидную связь в синтетическом субстрате-n-нитроанилиде γ-глутаминовой кислоты (γ-Glu-pNa) при pH 8,0;
диапазон pH-стабильности: 5,5-8,5 (при 7^оС в течение 7 дней, субстрат γ-Glu-pNa);
термостабильность: сохраняет активность при 22-37^оС в течение 80 ч, при 7^оС в течение 15 дней, при 75^оС в течение 15 мин;
константа Михаэлиса: 2,9˙10^-5 М (субстрат γ-Glu-pNa, pH 8,0, 25^oC);
каталитическая константа: 0,9 с^-1 (субстрат γ-Glu-pNa, pH 8,0, 25^оС);
ингибиторы: йодацетамид, йодацетат (при их концентрации не ниже 10^-2 М).

В отличие от дестабилазы заявляемый фермент имеет мол. мас. 15000 Д (12300 Д у дестабилазы), характеризуется большим сродством к субстрату γ-Glu-pNa: константа Михаэлиса К_m= 2,9˙10^-5 М (в случае дестабилазы К_m= 2,2˙10^-4 М) и более высокую скорость катализа: К_кат=0,9 с^-1 (в случае дестабилазы К_кат=3,53˙10^-3 с^-1).

Получение фермента включает фракционирование экстракта гомогената целых пиявок сульфатом аммония, очистку фракции 40-60%-ного насыщения на анионообменной смоле ДЕАЕ Toyopearl (0,02 М трис-HCl, pH 7,5) и катионообменной смоле СМ-Toyopearl (0,02 М N-морфолинэтансульфоновая кислота (МЕS), pH 5,5) и высокоэффективную гель-фильтрацию на колонке Superose-12 (0,02 M трис-HCl, pH 7,0).

В результате получают препарат, содержащий 80±5% активного вещества. Степень чистоты фермента подтверждена данными градиентного электрофореза в полиакриламидном геле (ЭФ в ПААГе) в присутствии додецилсульфоната натрия (SDS)- изоэлектрофокусирования и высокоэффективной гель-фильтрации.

Ниже приводится подробное описание методики выделения фибрин-изопептидазы.

П р и м е р. Получение фибрин-изопептидазы.

1. Получение экстракта гомогената из медицинской пиявки Hirudo medicinalis
10 штук целых пиявок измельчают в гомогенизаторе типа Blender в 40 мл физиологического раствора (0,9 NaCl). К полученному раствору прибавляют еще 50 мл физиологического раствора, перемешивают, выдерживают 30 мин при 25^оС и центрифугируют (30 мин при 5000 об/мин). К супернатанту (100 мл) прибавляют 20 мл 6% -ного раствора стрептомицинсульфата, выдерживают 30 мин при 0^оС и центрифугируют (30 мин при 5000 об/мин).

2. Фракционирование сульфатом аммония.

Полученный супернатант фракционируют сульфатом аммония сначала до 40% насыщения (28,8 г) и после формирования осадка (2 ч при 0^оС) и центрифугирования (30 мин при 5000 об/мин) прибавляют сульфат аммония до 60%-ного насыщения (16,9 г). Осадок формируют и центрифугируют (30 мин при 5000 об/мин) и промывают трижды (3х20 мл) раствором сульфата аммония 60%-ного насыщения.

3. Очистка фермента.

Полученный осадок разбавляют до 760 мл 0,02 М раствором трис-НСl, pH 7,5 и пропускают через колонку (1,5х9 cм) с анионообменной смолой ДЕАЕ-Toyopearl (Япония) со скоростью 5 мл/мин при 7^оС в том же буфере. В результате этой операции 84% нанесенного белка задерживается на смоле. Фибрин-изопептидазную активность при этом обнаруживают во фракции, содержащей 16% нанесенного белка, не связавшегося со смолой. Затем к этой фракции (780 мл) прибавляют раствор концентрированной НСl до pH 5,5 и наносят на колонку (1х8 см) с катионообменной смолой СМ-Toyopearl (2 мл/мин при 7^оС), предварительно уравновешенную 0,02 М МЕS, pH 5,5. В результате более 90% активного белка задерживается на смоле. Элюцию белка проводят раствором 0,2 М NaCl в 0,02 M MES, pH 5,5. Получают 7,9 мл раствора, содержащего 7,1 мг белка. Белок определяют по методу (Sedmak J.J. Grossberg S.S. Anal. Biochem. 1977, v. 79-, p.544-552). Полученную фракцию лиофилизуют, растворяют в 1 мл воды, раствор наносят на колонку Superose-12 (Pharmacia, Швеция), уравновешенную 0,02 М трис-НСl, pН 7,0 и осуществляют высокоэффективную гель-хроматографию (0,5 мл/мин, 0,5 атм. объем фракции 1 мл, хроматограф фирмы Altex, США), Фракции, содержащие активный белок, объединяют (6 мл) и лиофилизуют. В результате получают белковый препарат 80% -ной чистоты. Чистоту препарата определяют методом градиентного электрофореза в 4 ->> 16% ПААГе с 1% SDS и без него и методом изоэлектрофокусирования с 8,5 М мочевиной и без нее.

Были изучены физико-химические и энзимологические свойства нового фермента. При этом получены следующие характеристики.

УФ-спектр. Характерный максимум поглощения 275-278 нм.

Мол. мас. Мол. мас. 15000±1000 Д. Определена методом высокоэффективной гель-фильтрации на колонке Superose-12 (0,02 М трис-HCl, pH 7,0) и градиентного электрофореза в 4 ->> 16% ПААГе с 1% SDS.

N-концевая аминокислота. Фермент состоит из одной полипептидной цепи, на N-конце которой находится метионин.

Изоэлектрическая точка. pJ= 7,3±0,1. Изоэлектрическую точку определяли методом изоэлектрофокусирования при использовании амфолинов с диапазоном pH 3,5-10.

Изопептидазная активность. Изопептидазную активность фермента определяли в высокоспецифическом тесте по способности фермента гидролизовать изопептидные связи в природном субстрате продукте ограниченного протеолиза стабилизированного фибрина, димере его D-фрагмента (D-димер), в котором сохранены изопептидные связи между γ-цепями фибрина (Завалова Л.Л. Никонов Г.И. и др. Биохимия, т. 56, 1991, с.115-124). С этой целью 0,1-2,0 мкг фермента инкубировали с 50 мкг D-димера в 0,02 М трис-НСl буфере при pH 8,0 в течение 10-70 ч. Общий объем инкубационной пробы 100 мл. В результате реакции наблюдали гидролиз изопептидной связи в D-димере и образование двух идентичных D-мономеров, за накоплением которых наблюдали с помощью метода ЭФ в ПААГ.

Амидолитическая активность. Амидолитическую активность фермента определяли по его способности гидролизовать амидную связь в γ-Glu-pNa с образованием n-нитроанилина по методу (Баскова И.П. Никонов Г.И. и др. Биохимия, т. 55, 1990, с.674-679). Для этого 10-100 мкл раствора фермента прибавляли к пробе, содержащей 0,02 М трис-HCl, pH 8,0 и 0,05 мг/мл γ-Glu-pNa в общем объеме 0,5 мл, и инкубировали 5-30 мин при 25^оС. За развитием реакции следили спектрофотометрически при длине волны 405 нм (коэффициент молярной экстинкции ζ=9694 М^-1˙см^-1). Следует отметить, что ни тромбин, ни трипсин, ни химиотрипсин не гидролизуют этот субстрат в аналогичных условиях.

Диапазон pH-стабильности. Фермент стабилен в диапазоне pH 5,5-8,5 при 7^оС в течение 7 дней (субстрат γ-Glu-pNa).

Термостабильность. Фермент сохраняет активность при 22-37^оС в течение 80 ч, при 7^оС в течение 15 дней, при 75^оС в течение 15 мин.

pH-оптимум. Оптимум pH 7,3 (субстрат γ-Glu-pNa).

Константа Михаэлиса. К_m=2,9˙10^-5 М (субстрат γ-Clu-pNa, pH 8,0, 25^oC).

Каталитическая константа. 0,9 с^-1 (субстрат γ-Glu-pNa, pH 8,0, 25^oC).

Ингибиторы. Фермент чувствителен к действию ингибиторов тиоловых протеиназ-йодацетамиду и йодацетату (при их концентрации не ниже 10^-2М). 60%-ное ингибирование наблюдается после преинкубации при 25^оС в течение 1 ч.

Фермент не чувствителен к действию ингибиторов сериновых протеиназ (p-метилсульфонилфторида, диизопропилфторфосфата).

Использование: биология и может быть применено в медицине, для лечения застарелых тромбозов и тромбоэмболических состояний. Сущность изобретения: фибрин-изопептидаза новый фермент, выделенный из медицинской пиявки Hirudo medicinalis, обладает изопептидазной и амидолитической активностью и имеет следующие свойства: мол. м. 15000 ± 1000 (гельфильтрация на Superose-12 и ЭФ и ПААГе с SDS); изоэлектрическая точка 7,3 ± 0,1 (изоэлектрофокусирование в ПААГе в присутствии амфолитов), субстратная специфичность: фермент гидролизует γ = Glu = ζ = Lys изопептидные связи в продукте ограниченного протеолиза фибрина димере его d-фрагмента pH 8,0 и амидную связь в синтетическом субстрате γ = Glu = pNa (pH 8,0); диапазон pH-стабильности 5,5 8,5 (при 7°С в течение 7 дней, субстрат γ = Glu = pNa ) термостабильность: сохраняет активность при 22 37°С в течение 80 ч, при 7°С в течение 15 дней, при 75°С в течение 15 мин; ингибиторы: йодацетамид, йодацетат (при их концентрации не ниже 10^-2M): константа Михаэлиса: 2,9·10^-5M (субстрат γ = Glu = pNa pH 8,0, 25°С). Получение фермента включает фракционирование экстракта гомогената целых пиявок сульфатом аммония, очистку фракции 40 60%-ного насыщения на анионообменной смоле ДЕАЕ-Toyoplarl (0,02 М трис-HCl, pH 7,5) и катионообменной смоле СМ-Toyopearl (0,02 М H-морфолинэтансульфоновая кислота, pH 5,5) и высокоэффективную гель-фильтрацию на колонке Superose-12 (0,02 М трис HCl, pH 7,0).

ФИБРИН-ИЗОПЕПТИДАЗА, выделенная из медицинской пиявки Hirudo medicinalis обладающая изопептидазной и амидолитической активностью и имеющая следующие свойства:
молекулярная масса 15000 ± 1000 дальтон;
изоэлектрическая точка 7,3 ± 0,1;
субстратная специфичность: гидролизует γ-Glu-E-Lys- изопептидные связи в продукте ограниченного протеолиза фибрина димере его D-фрагмента (pH 8,0) и амидную связь в синтетическом субстрате γ-Glu-pNa (pH 8,0);
диапазон pH стабильности: 5,5 8,5 (при 7^oС в течение 7 дней, субстрат γ-Glu-pNa),
термостабильность: сохраняет активность при 22 37^oС в течение 80ч, при 7^oС в течение 15 дней, при 75^oС в течение 15 мин;
константа Михаэлиса: 2,9 10^-5 М (субстрат γ-Glu-pNa, pH 8,0, 25^oС);
каталитическая константа: 0,9 с^-1 (субстрат γ-Glu-pNa, рH 8,0, 25^oС);
ингибиторы: йодацетамид, йодацетат (при их концентрации не ниже 10^-2 М).