СПОСОБ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА КОРМОВЫХ И ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ Российский патент 1995 года по МПК G01N33/18 

Изобретение относится к комбикормовой, пищевой отрасли промышленности и может использоваться в таких областях сельского хозяйства, как свиноводство, птицеводство, рыбоводство, коневодство, звероводство и овощеводство.

Известен способ оценки токсичности водной среды с помощью культуры простейших [1]
Однако данный метод не позволяет определить безвредность кормовых и пищевых компонентов
Известен также способ оценки безвредности кормовых и пищевых продуктов с помощью простейших Tetrahymena pyriformis [2]
Недостатком этого способа является высокая трудоемкость и длительность анализа (3-4 сут).

Наиболее близким техническим решением предлагаемого способа является способ оценки токсичности кормового продукта путем его измельчения, приготовления на его основе питательной среды, введение в нее тест-объекта инфузорий стилонихий Stylonichia mytilus и сравнение прироста численности инфузорий в среде инкубации без корма (контроль) и в среде с кормом (опыт) [3]
К недостаткам этого способа относятся сравнительно невысокая экспрессность, точность и трудоемкость.

Целью изобретения является ускорение анализа, повышение точности измерения и снижение трудоемкости.

Поставленная цель достигается тем, что в предложенном способе используется водно-ацетоновый или водно-спиртовый экстракт в концентрациях соответственно 0,6-1,3% и 0,4-0,8%
Экстракция данными растворителями обеспечивает максимально полное извлечение токсических веществ из продуктов по сравнению с их извлечением только водной фазой. Кроме того, растворители увеличивают проницаемость липопротеидных мембран, способствуя тем самым проникновению через клеточную оболочку чужеродных веществ. Наконец, указанные концентрации растворителей снижают двигательную активность инфузорий, что облегчает подсчет тест-организмов под бинокуляром и повышает точность измерений.

Следует также отметить, что для инфузорий стилонихий концентрации ацетона 0,6-1,3% и спирта 0,4-0,8% являются пороговой физиологической нагрузкой, которая в сочетании с извлекаемым из продуктов органическими веществами сенсибилизирует клетки инфузорий. Такие организмы с повышенной чувствительностью даже на низкие концентрации токсических веществ отвечают лизисом клеточной оболочки. Подобная специфическая реакция тест-организмов, с одной стороны, существенно повышает точность измерений, так как просчитываются только интактные живые клетки, с другой, ускоряют время проведения анализа до 1-5 ч по сравнению с 24-26 ч в прототипе.

Способ осуществляется следующим образом.

Исследуемый продукт в количестве 10 г измельчают, заливают ацетоном или спиртом в объеме 10-15 мл, встряхивают 2 мин и отстаивают в течение 15 мин. Экстракт в количестве 0,5 мл разбавляют отстоянной в течение недели водопроводной водой до концентрации растворителя 0,4-1,3% Соотношение воды и растворителя для каждого вида продукта указано в табл. 1.

Перед добавлением водных растворов экстрактов в микроаквариумы (каждый образец в пять микроаквариумов) в них вносят инфузорий в количестве 10-20 шт. в каждый микроаквариум, которые подсчитывают с помощью бинокуляра. После этого объем содержимого микроаквариума доводят до 0,4-0,5 мл путем добавления водного раствора экстракта. В результате плотность инфузорий составляет 20-40 шт. /мл. Через 1 ч вторично подсчитывают численность инфузорий. В контроле (0,6-1,3% ацетона или 0,4-0,8% раствора спирта этилового в воде) инфузории должны остаться живыми, в опыте в случае некачественного продукта инфузории подвергаются лизису. Степень токсичности испытуемого продукта определяют по выживаемости инфузорий после 1 ч экспозиции в водно-ацетоновом или в водно-спиртовом экстракте. Выживаемость инфузорий (V) вычисляют по формуле
V × 100, где N_t среднее арифметическое (из пяти повторностей) количества инфузорий через 1 ч экспозиции, шт.

N_o среднее арифметическое (из пяти повторностей) количества инфузорий в начале опыта, шт.

Степень токсичности продукта определяют по табл. 2.

Навеска пробы должна быть постоянного веса и составлять 10 г. Это сделано для простоты проведения анализа, так как в случае отклонения от этой величины необходимо будет каждый раз даже для одного и того же продукта изменять такой параметр как количество добавляемого растворителя с тем, чтобы достигнуть определенной степени разбавления и соответственно концентрации извлекаемого продукта.

Объем растворителя колеблется в диапазоне 10-15 мл в зависимости от консистенции продукта (твердый или сыпучий), его происхождения (растительного или животного) и влажности. При объеме растворителя меньше 10 мл количество образуемого экстракта недостаточно для приготовления раствора, при объеме больше 15 мл для приготовления раствора потребуется большее количество экстракта; в результате концентрация растворителя превысит предельный уровень функциональной нагрузки и лизис инфузорий будет иметь место даже в отсутствии токсикантов.

Минимальное время встряхивания составляет 2 мин. Это тот срок, за который происходит практически полная экстракция токсикантов. Увеличение длительности встряхивания не ведет к более полному извлечению токсикантов и поэтому указанный временной интервал не следует расширять.

Время отстаивания пробы 15 мин, также как и предыдущий параметр (время встряхивания), выбрано опытным путем. За этот срок оседают грубо- и среднедисперсные фракции, а тонкодисперсная взвесь остается в экстракте и наряду с растворенной фазой является фактором токсичности. Поэтому при более длительном отстаивании (в течение нескольких часов) перед приготовлением раствора требуется повторное легкое однократное встряхивание и последующее отстаивание в течение 15 мин.

Объем отбираемого для приготовления раствора экстракта в количестве 0,5 мл это максимальная величина, которую сравнительно легко без взвеси можно отобрать после отстаивания пробы любого продукта. Этот же объем экстракта диктуется соображениями экономии растворителя.

Количество вносимых в раствор инфузорий берется произвольно в диапазоне 20-40 шт. /мл. При меньшей плотности посадки увеличивается ошибка измерения из-за возможной количественной недооценки тест-организмов. Кроме того, в результате большой погрешности становится невозможным строгий количественный анализ и шкала токсичности будет неполной только с двумя уровнями градации нетоксичный и токсичный продукт без промежуточного уровня. При плотности посадки выше 40 шт./мл возрастает ошибка подсчета и, следовательно, ошибка измерения, что в итоге также затрудняет строгий количественный анализ и построение шкалы с различными уровнями токсичности. Наконец, при высокой плотности посадки сказывается эффект биомассы, что ведет к занижению токсичности.

Выбор в качестве критеpия оценки безвредности продукта выживаемости инфузорий обусловлен рядом причин. Во-первых, этот показатель в условиях физиологической нагрузки характеризуется высокой чувствительностью, что позволяет улавливать весьма слабую токсичность. Во-вторых, выживаемость это объективный критерий, обеспечивающий количественную оценку эффекта с высокой точностью (5%). Это, в свою очередь, позволяет устанавливать строгую градацию степени токсичности продукта. Наконец, результаты производственных испытаний на рыбоводных хозяйствах, свинокомплексах и зверохозяйствах показали 85-90% корреляцию между процентом выживаемости инфузоpий и нормой реакций объектов выращивания (рыбы, свиньи, звери). Шкала токсичности испытуемых продуктов в зависимости от процента выживаемости инфузорий, в диапазонах 81-100% 50-80% и 0-49% прокалибрована по результатам стандартных арбитражных методов оценки токсичности биопробы на мышах и по кожной пробе кроликов.

П р и м е р 1. Для приготовления среды инкубации берут водопроводную воду объемом 1 л, отстаивают 7 сут, фильтруют через двойной слой фильтровальной бумаги и двукратно стерилизуют при 75-80^оС в течение 15 мин с интервалом 1 сут.

Навеску нетоксичности комбикорма для рыб весом 10 г помещают в пробирку, заливают ацетоном в количестве 14 мл (табл. 1), встряхивают в течение 2 мин и отстаивают 15 мин. Экстракт в количестве 0,5 мл разбавляют в 100 раз отстоянной в течение одной недели и отфильтрованной водой объемом 50 мл, доводя таким путем концентрацию ацетона до 1,0%
Перед добавлением экстрактов в микроаквариумы (каждый образец в пять микроаквариумов) в них вносят по капле среды с инфузориями в количестве 10-20 шт. в каждый микроаквариум, численность которых просчитывают под бинокуляром (N_o). Затем объем содержимого микроаквариума доводят до 0,5 мл путем добавления водного раствора экстракта, при этом плотность инфузорий составляет 20-40 шт./мл. Через 1 ч вторично просчитывают численность инфузорий в микроаквариумах (N_t).

При концентрации ацетона 1% и соответствующем количестве экстрагируемых из корма органических веществ оба эти фактора обеспечивают оптимальный уровень физиологической нагрузки, который повышает чувствительность тест-организмов к неблагоприятному воздействию, но не вызывает их гибели. В этом случае выживаемость инфузорий составляет 90% (табл. 3, п. 1), т.е. корм относится к категории нетоксичных (табл. 2).

П р и м е р 2. То же, что в примере 1, но экстракт разбавляется в 160 раз до концентрации ацетона 0,62% которая ниже оптимального значения для рыбного корма (1% ). В этих условиях выживаемость инфузорий составляет 96% (табл. 3, п. 2), поэтому корм как и в первом случае классифицируется как нетоксичный (табл. 2).

П р и м е р 3. То же, что в примере 1, за исключением того, что экстракт разбавляется в 200 раз. При этом разбавлении концентрация ацетона снижается до 0,5% и выживание инфузорий составляет 92% т.е. корм как и в предыдущем случае также является нетоксичным (табл. 3).

П р и м е р 4. То же, что в примере 1, за исключением того, что экстракт разбавляется в 80 раз. Уменьшение степени разбавления экстракта и повышение концентрации ацетона до 1,24% по сравнению с оптимальным значением для данного продукта (1%) приводит к тому, что подобная физиологическая нагрузка превышает норму, снижает выживаемость инфузорий до 68% (табл. 3, п. 4) и корм относится к категории слаботоксичных (табл. 2).

П р и м е р 5. То же, что в примере 1, за исключением того, что экстракт разбавляется в 40 раз. При этом разбавлении выживаемость инфузорий снижается еще в большей степени (до 26%) по сравнению с предыдущим примером (табл. 3, п. 5) и корм классифицируется как токсичный (табл. 2).

П р и м е р 6. То же, что в примере 1, за исключением того, что образец рыбного корма по рыбоводным показателям является токсичным (срок хранения втрое превышает допустимый по нормативам). В этом случае выживаемость инфузорий составляет 32% (табл. 3, п. 6) и корм является токсичным.

П р и м е р 7. То же, что в примере 6, за исключением того, что длительность выдерживания инфузорий в водном экстракте составляет 1,5 ч. Увеличение времени экспозиции с 1 ч до 1,5 ч практически не изменяет процента выживаемости, который составляет 37% (табл. 3, п. 7), т.е. и в предыдущем случае корм токсичный (табл. 2).

П р и м е р 8. То же, что в примере 6, за исключением того, что время экспозиции равно 0,5 ч. В этом случае время экспозиции недостаточно для проявления токсического эффекта, поэтому процент выживаемости возрастает до 63% (табл. 3, п. 8) и продукт по шкале токсичности классифицируется как слаботоксичный.

П р и м е р 9. То же, что в примере 6, за исключением того, что время экспозиции составляет 2 ч. Столь длительное выдерживание по существу не сказывается на выживаемости инфузорий, которая равняется 33% (табл. 3, п. 9), т.е. продукт является токсичным.

Экономэффект от использования способа в народном хозяйстве складывается из прямого и непрямого эффектов. Прямой эффект образуется за счет экономии от замены стандартных методов (кожная проба на кролике и мыше) на предлагаемый способ.

Расчет ожидаемого непрямого экономэффекта оценивается при использовании предлагаемого способа за счет предотвращенного ущерба от болезней органов пищеваpения.

При оценке реального экономэффекта необходимо учитывать также такой важный параметр как экспрессность анализа. В предлагаемом способе длительность анализа 1-1,5 ч, тогда как в стандартных биотестах от 4 до 7 сут и выше. Поэтому способ на инфузориях позволяет оценивать качество продукта по существу "с колес" и таким образом предотвращать возможные ущербы от использования недоброкачественного продукта, что особенно важно в животноводстве.

Способ может найти применение в комбикормовой, пищевой промышленности, а также в таких областях сельского хозяйства как свиноводство, птицеводство, рыбоводство, коневодство, звероводство и овощеводство. Испытанию на токсичность с помощью инфузорий могут подвергаться продукты различной природы: животного происхождения: мука мясокостная и рыбная, свежее и мороженое мясо животных, птиц, рыб, моллюсков, ракообразных, субпродукты; растительного происхождения: зерно всех видов и продукты его переработки (жмыхи, шроты, мучки, отруби, лузга), мука травяная и водорослевая, овощи; продукты микробиосинтеза: различные виды кормовых дрожжей (гидролизные дрожжи, паприн, эприн и др.).

Использование: комбикормовая и пищевая промышленность, свиноводство, птицеводство, рыбоводство, коневодство, звероводство и овощеводство. Сущность применения: готовят водно-ацетоновый или водно-спиртовый экстракт из исследуемого продукта и культивируют культуру инфузорий в среде с полученным экстрактом, оценку качества проводят по количеству выживших особей. 3 табл.

СПОСОБ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА КОРМОВЫХ И ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ, включающий отбор пробы исследуемого продукта, ее измельчение, внесение в среду с культурой инфузорий stylonichia mytilus, выдерживание и оценку физиологического параметра инфузорий, отличающийся тем, что после измельчения пробы исследуемого продукта дополнительно готовят ацетоновый или спиртовой экстракт пробы при концентрации растворителя 0,6 1,3% и 0,4 0,8% соответственно, культуру инфузорий вносят в среду с продуктом в количестве 20 40 шт./мл, выдерживают в течение 1 1,5 ч, в качестве физиологического параметра оценивают процент выживших особей и при 81 100% выживших особей от их исходного числа считают исследуемый продукт нетоксичным, при 50 80% выживших особей слаботоксичным, а при меньшем количестве выживших особей токсичным.