БИОПРЕПАРАТ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВЫ И ВОДЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 1996 года по МПК C02F3/34 C09K3/32 B09C1/10 B09C101/00 

Изобретение относится к нефтяной промышленности, сельскому хозяйству и экологии и может быть использовано для биологической очистки почв и поверхностных вод от нефтезагрязнений.

Нефтезагрязнение почвы и воды в результате аварий при транспортировке, неудачных эксплуатационных приемов добычи нефти и других причин наносит значительный ущерб экологии, рыбному и сельскому хозяйству. Восстановление нефтезагрязненных земель и очистка поверхностных вод представляет собой широкий комплекс мероприятий. Во всем мире ведутся интенсивные исследования в части изучения действия нефти на живую природу, разрабатываются способы ускорения деградации нефти в почве или на поверхности воды. Установлено, что микроорганизмы выступают в роли особых катализаторов разложения нефти. Абиотические факторы непосредственно не оказывают существенного влияния на этот процесс: действие этих факторов приобретает существенную роль, исключительно влияя на жизнедеятельность нефтеокисляющих микроорганизмов (температура, влага и т. п.). Практическое использование соответствующих микроорганизмов осуществляется путем внесения их в почву в форме различных препаратов. При этом используются различные роды, виды и штаммы микроорганизмов в качестве единственного средства окисления нефти в почве или воде бактерии: Micrococcus, Mycobacterium, Paracoccus, Spirillum или грибы: Penicillum, Verticillum (Коронелли Т.В. Степанова Л.Н. Исследования парафинокисляющих штаммов Pseudomonas, Микробиология, 1968, т. 37, вып. 3, с. 460-465. Davies J.S. Westlake D.W.S. Crude oil utilization by fungy. Canad. J. Microbiol. 1970. v. 25, N 2 р. 146-156). В соответствующих литературных источниках указаны и другие микроорганизмы, в той или иной мере способные ассимилировать нефть. Они выделены в различных местах земного шара из природных источников. Нефтеокисляющая деятельность бактерий протекает в аэробных условиях.

Микроорганизмы (бактерии), имеющиеся в коллекции авторов, характеризуются показателями окисления нефтяных углеводородов (данные приводятся для "лучших" штаммов), приведенными в табл. 1.

П р и м е ч а н и е Грибы отличаются от бактерий значительно более низкой способностью утилизации углеводородов нефти. Следует подчеркнуть, что в процессе окисления нефти штаммам, хотя и принадлежит ведущая роль, однако практическое использование микробной деградации и нефти определяется составом биопрепарата, что определяет жизнеспособность бактерий, их количеством и, наконец, технологией использования препаратов в практических целях.

Известен бактериальный препарат "Путидойл", предназначенный для ускорения разложения нефти [1] Несмотря на то, что авторы указывают на его эффективность, но тем не менее ему присущи существенные недостатки.

Технология изготовления препарата предусматривает распылительную сушку живой культуры бактерий, что вызывает травмирование бактерий и, как следствие, их гибель или потерю необходимой активности. Для восстановления их жизнедеятельности авторы применяют сложный комплекс мер подогрев большого количества воды (5 м³) до 18-28^оС, перемешивание, аэрирование, и все это в течение длительного времени (16-24 ч), что в полевых условиях выполнить довольно сложно.

Препарат "Путидойл" оказывает угнетающее действие на естественный микробный ценоз (Новиков Ю.В. и Комзолова Н.В. Исследования бактериального препарата Путидойл, предназначенного для очистки водоемов от нефти. Водное хозяйство, 1992, N 2, с. 121-123).

В естественных условиях препарат оказался малоэффективным.

Целью предлагаемого изобретения является создание высокоэффективного бактериального препарата (предполагаемое промышленное название "Нафтокс"), лишенного указанных недостатков и способного активизировать процесс окисления нефти и нефтепродуктов, создавая таким образом предпосылки для рекультивации нефтезагрязненных почв, очистки поверхностных вод и улучшения экологической обстановки.

Поставленная цель достигается использованием бактериального препарата, состоящего из одного или нескольких штаммов нефтеокисляющих бактерий, выращенных на влажных субстратах-носителях с заданными свойствами (таких, как торф, вермикулит и т.п.), предварительно простерилизованных гамма-облучением, обогащенных дополнительными источниками углерода и энергии. Препарат "Нафтокс" получают по известной технологической схеме, принятой для производства препаратов азотфиксирующих бактерий (а.с. N 922104, 1982).

С целью поддержания постоянно высокой углеводородокисляющей активности используемых штаммов в качестве источников углерода и энергии используют нормальные парафины ряда С₁₂-С₁₈, а в качестве активатора окислительной активности бактерий аммоний щавелевокислый. Известен способ стимулирования жизнедеятельности микроорганизмов путем введения в субстрат янтарной кислоты (а.с. N 1712347, 1982).

В предварительных опытах было показано, что щавелевокислый аммоний в значительной степени превосходит янтарную кислоту по признаку, способствующему накоплению клеток в жидкой и торфяной культурах (почвенной) при выращивании в присутствии парафинов в качестве единственного источника углерода и энергии. Кроме того, щавелевокислый аммоний в отличие от янтарной кислоты доступный и недорогой компонент. Более высокая биологическая активность щавелевокислого аммония по сравнению с янтарной кислотой представлена в табл. 2 (накопление клеток в млрд/мл или млрд/г).

Активность культуры Mycobacterium phley 5KB в присутствии различных стимуляторов (возраст жидкой культуры 72 ч, твердофазной 7 суток, накопление клеток в млрд/г (мл).

Полученные данные легли в основу предлагаемого изобретения. Опыты, проведенные с другими нефтеокисляющими бактериями (Pseudomonas-D, Rhodococcus), показали принципиально одинаковые результаты.

Ограничительные данные и выбор оптимальных концентраций щавелевокислого аммония в торфяной культуре Mycobacterium phley-5KВ представлены в табл. 3.

Для Pseudomonas-D, Rhodococcus получили практически одинаковые результаты в части выбора концентрации щавелевокислого аммония. Таким образом установлено, что в гамма-стерильном торфе, обогащенном жидкими парафинами, нефтеокисляющие бактерии родов Mycobacterium, Pseudomonas, Rhodococcus способны активно расти и накапливать относительно высокие титры 3-3,4 млрд/г; щавелевокислый аммоний в концентрациях 0,05-0,25 на сухой вес торфа почти удваивает количество бактерий в препарате при сравнительно длительном времени хранения. В отдельных опытах получено, что при хранении препарата в течение 3-6 месяцев, хотя титры заметно снижаются, но в присутствии щавелевокислого аммония этот процесс несколько замедляется (см. табл. 4).

В цитированном выше а.с. N 922104 указано, что концентрация углеводов в сухом субстрате-носителе составляет 3% В случае использования углеводородов для обогащения торфа эта величина для нефтеокисляющих бактерий оказалась меньшей и составила 1-1,5% (см. табл. 5).

Оптимальная концентрация С₁₂-С₁₈ в субстрате-носителе находится в пределах 1,0-1,5%
П р и м е р 1.

Торф нейтрализуют мелом до рН 6,8-7,0, увлажняют до 35-40% обогащают смесью углеводородов С₁₂-С₁₈ до концентрации 1,0-1,5% на сухой вес субстрата (постоянное перемешивание), упаковывают в полиэтиленовые мешки с коэффициентом заполнения 0,4-0,5, подвергают гамма-облучению в дозе 15 кГр (1,5 Мрад). Пакет, содержащий 230 г влажного стерильного торфа (около 140 г сухого), 70 мл культуры и 35-175 мг ЩКА, выдерживают при температуре 18-20^оС в течение 5-7 дн. (подращивание). Концентрация клеток в 1 г препарата 3х10⁹ кл. конечная влажность препарата 55-60%
П р и м е р 2.

Торф нейтрализуют мелом до рН 6,8-7,0, увлажняют до 35-40% обогащают смесью углеводородов С₁₂-С₁₈ до концентрации 1,5% на сухой вес субстрата-носителя (постоянное перемешивание), упаковывают в полиэтиленовые пакеты с коэффициентом заполнения 0,4-0,5 и подвергают гамма-облучению в дозе 15 кГр (1,5 Мрад). Пакет, содержащий 230 г влажного стерильного торфа (около 140 г сухого), 70 мл культуры Micobacterium 5 КВ и 175 мг щавелевокислого аммония, выдерживают при температуре 18-20^оС в течение 5-7 дн. (подращивание). Конечная концентрация 5КВ в одном грамме препарата составляет 4х10⁹кл, влажность препарата 55-60%
При необходимости и, располагая более активными штаммами, например Rhodococcus, аналогичным образом получаем биопрепараты с другими микроорганизмами.

Полученные препараты используются для очистки от нефти почв и поверхности водоемов. Препарат наносят на поверхность почвы в количестве 50-300 кг/га. Норма расхода препарата определяется степенью нефтяного загрязнения (см. табл. 6).

Препарат запахивают на глубину 20-25 см и при необходимости почву известкуют до рН 6,0-6,5. Периодически 3-4 раза за сезон почву рыхлят культиваторами. Постоянно поддерживают оптимальную влажность (60% от полной влажности). Весь процесс очистки почвы рассчитан на весенне-летний период продолжительностью 4-6 мес. Как показывает опыт работ, нагрузка 50 кг/га является предельной для успешной биологической очистки.

Использование: изобретение относится к нефтяной промышленности, сельскому хозяйству и экологии и может быть использовано для биологической очистки почв и поверхностных вод от нефтезагрязнений. Сущность: предложен биопрепарат (коммерческое название "Нафтокс"), состоящий из высокоактивных живых аэробных нефтеокисляющих бактерий (Mycobacterium, Pseudomonas и др.), выращенных на твердых субстратах-носителях с титрами 2,5 - 7 • 10⁹ кл/мл в зависимости от рода и вида используемых бактерий. С целью увеличения потенциальной нефтеокисляющей активности и поддержания необходимых высоких титров в процессе длительного хранения препарата в субстрат-носитель дополнительно вводят 0,05 - 1,0% аммония щавелевокислого и 1,0 - 1,5% нормальных парафинов. Биопрепарат непатогенен, не загрязняет окружающую среду, удобен в хранении и транспортировке. Срок годности - 6 мес. при температуре 10 - 15^oС с момента его изготовления. 3 з. п. ф-лы, 6 табл.

1. БИОПРЕПАРАТ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВЫ И ВОДЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ, включающий аэробные нефтеокисляющие бактерии и наполнитель, отличающийся тем, что дополнительно вводят нормальные парафины С_1 2 - С_1 8 и аммоний щавелевокислый, а в качестве наполнителя используют органический или минеральный твердый субстрат и воду при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Органический или минеральный твердый субстрат - 40 - 45
Нормальные парафины С_1 2 - С_1 8 - 1 - 1,5
Аммоний щавелевокислый - 0,05 - 0,25
Вода - 58,95 - 53,25
Аэробные нефтеокисляющие бактерии - В эффективном количестве (кл/г препарата)
2. Биопрепарат по п.1, отличающийся тем, что в качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий он содержит бактерии Micobacterium phlei в конечной концентрации не менее 2,5 • 10⁹ клеток/г препарата. 3. Биопрепарат по п. 1, отличающийся тем, что в качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий он содержит бактерии Pseudomonas aeruginosa в конечной концентрации не ниже 6 • 10⁹ клеток/г препарата. 4. Биопрепарат по п. 1, отличающийся тем, что в качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий он содержит бактерии Rodococcus species в конечной концентрации не ниже 7 • 10⁹ клеток/г препарата.