БИОПРЕПАРАТ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВЫ И ВОДЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 2011 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 C09K3/32 B09C1/10 

Изобретение относится к жидким (водосодержащим) препаратам для микробиологической очистки почв и поверхностей водоемов от нефти и нефтепродуктов.

Очистка почв и водоемов от загрязнений нефтью и нефтепродуктами является актуальной и сложной задачей защиты окружающей среды. Одним из направлений решения этой задачи является очистка загрязненных почв и поверхности воды с помощью биологических препаратов (биодеструкторов), при обработке которыми происходит разрушение углеводородов нефти за счет интродукции в загрязненную экосистему нефтеокисляющих микроорганизмов.

Известен бактериальный препарат "Путидойл" [ТУ 64-16-75-91. Препарат бактериальный Путидойл], предназначенный для ускорения разложения нефти, в состав которого входит углеводородокисляющий штамм Pseudomonas putida. Его недостатком является сложная технология приготовления, которая предусматривает распылительную сушку живой культуры бактерий. Такой метод сушки не позволяет получить препарат с высоким титром клеток вследствие инактивации клеток под действием высоких температур. (+60°С). Для восстановления жизнедеятельности бактерий перед использованием препарата применяют следующие меры: перемешивают препарат в большом количестве подогретой до 18-28°С воды, и производят аэрирование в течение длительного времени (16-24 ч). Это усложняет, а порой делает неприемлемым применение препарата в полевых условиях. Кроме того, препарат "Путидойл" оказывает угнетающее действие на естественный микробный ценоз [Новиков Ю.В. и Комзолова Н.В. Исследования бактериального препарата Путидойл, предназначенного для очистки водоемов от нефти. Водное хозяйство, 1992, N 2, с.121-123].

Известен водосодержащий биопрепарат "Лессорб-био", защищенный патентом РФ 2193533 [патентом на изобретение РФ 2193533, опубл. 27.11.2002], который содержит аэробные нефтеокисляющие бактерии и органический субстрат - сорбент "Лессорб" (17,5-10,5%), представляющий собой продукт обработки растительного материала (мох, древесина, торф). В качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий биопрепарат содержит штаммы: Mycobacterium flavescens EX-91, Mycobacterium species ИЖ 4, Rhodococcus species 56Д, Acinetobacter species HB-1, подобранные в соответствии с условиями очищаемой территории. Недостатком этого препарата, как и описанного выше, является сложность состава, в том числе бактериального, а также сложность многостадийной технологии приготовления, которая предусматривает раздельное выращивание компонентов микробной массы, приготовление концентрированной клеточной суспензии, перемешивание с сорбентом и последующую сушку компонентов.

В качестве прототипа выбран биопрепарат «Нафтокс» для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов, описанный в патенте РФ 2053206 [Патент РФ на изобретение №2053206, опубл. 27.01.1996]. Препарат содержит нормальные парафины (C₁₂-C₁₈) - 1,0-1,5%, щавелевокислый аммоний (ЩКА) - 0,05-0,1%, воду - 98,95-98,40 и аэробные нефтеокисляющие бактерии, входящие наряду с водой в состав культуральной жидкости. В качестве бактерий в препарате использованы Mycobacterium phlei или Pseudomonas aeruginosa или Rhodococcus species. Препарат позволяет достаточно эффективно производить очистку почвы и поверхности воды от нефтяных загрязнений, имеет несложную технологию приготовления, однако, как показали испытания, имеет срок хранения не более 1 мес.

Задача, решаемая изобретением, - увеличение срока хранения (сохранения жизнеспособности бактерий) препарата до 3-х месяцев.

Достигаемый технический результат - подавление вредного воздействия продуктов жизнедеятельности бактерий на сами бактерии.

Задача решается тем, что биопрепарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов, включает водосодержащую культуральную жидкость на основе аэробных нефтеокисляющих бактерий, нормальные парафины C₁₂-C₁₈, щавелевокислый аммоний и дополнительно содержит хлористый калий, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

нормальные парафины С₁₂-C₁₈ 1,0-1,5 щавелевокислый аммоний 0,05-0,1 хлористый калий 0,1-0,5 водосодержащая культуральная   жидкость на основе аэробных   нефтеокисляющих бактерии остальное до 100

В качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий биопрепарат может содержать бактерии Mycobacterium phlei штамм 5КВ (депонированный во ВНИИСХТ под №375 А) в конечной концентрации не ниже 5 10⁹ клеток/мл препарата, или бактерии Pseudomonas aemginosa штамм 4D (коллекция заявителя - ФГУП «ВНИГРИ») в конечной концентрации не ниже 6·10⁹ клеток/мл препарата, или Rhodococcus species штамм 1АХ (коллекция заявителя - «ВНИГРИ») в конечной концентрации не ниже 7·10⁹ клеток/мл препарата. Биопрепарат отличается также тем, что перед применением его разводят водой максимально в соотношении 1:100.

Заявленный биопрепарат готовят следующим образом.

В отличие от прототипа, в котором нормальные парафины ряда C₁₂-C₁₈ и щавеливокислый аммоний вносятся при приготовлении рабочей формы препарата, в настоящем изобретении нормальные парафины ряда C₁₂-C₁₈ и щавеливокислый аммоний (ЩКА) вносят в ферментационную среду, содержащую аэробные нефтеокисляющие бактерии и воду, на их основе получают водосодержащую культуральную жидкость, и уже в нее вносят хлористый калий.

Пример 1

Для приготовления 100 г препарата в водосодержащую кукурозо-мелассовую ферментационную среду, содержащую соли калия, кальция и магния, вместе с посевным материалом - Mycobacterium phlei, штамм 5КВ, в количестве 50×10⁶ клеток/мл, добавляют 0,1 г ЩКА и 1 г нормальных парафинов ряда C₁₂-C₁₈. Через 48 ч при титре Mycobacterium phlei штамм 5КВ 5.1×10⁹ клеток/мл в водосодержащую культуральную жидкость вводят хлористый калий в количестве 0,1 г, что соответствует ~0,1 мас.% хлористого калия, ~0,1 мас.% ЩКА, ~1 мас.% нормальных парафинов ряда C₁₂-C₁₈ в биопрепарате.

Пример 2

Для приготовления 100 г препарата в водосодержащую ферментационную среду, содержащую глицерин, дрожжевой экстракт, соли калия и магния, вместе с посевным материалом в количестве 50×10⁶ клеток/мл Pseudomonas aeruginosa штамм 4D, добавляют 0,1 г ЩКА и 1 г нормальных парафинов ряда C₁₂-C₁₈. Через 48 ч при титре Pseudomonas aeruginosa 4D - 6,5×10⁹ клеток/мл в водосодержащую культуральную жидкость вводят хлористый калий в количестве 0,1 г, что соответствует ~0,1 мас.% хлористого калия, ~0,1 мас.% ЩКА, ~1 мас.% нормальных парафинов ряда C₁₂-C₁₈ в биопрепарате.

Пример 3

Для приготовления 100 г препарата в водосодержащую кукурозо-мелассовую ферментационную среду, содержащую соли калия, кальция и магния, вместе с посевным материалом в количестве 50×10⁶ клеток/мл Rhodococcus species штамм 1АХ добавляют 0,1 г ЩКА и 1 г нормальных парафинов ряда C₁₂-C₁₈. Через 48 ч при титре Rhodococcus species штамм 1АХ - 7.4 ×10⁹ клеток/мл в водосодержащую культуральную жидкость вводят хлористый калий в количестве 0,1 г, что соответствует ~0,1 мас.% хлористого калия, - 0,1 мас.% ЩКА, ~1 мас.% нормальных парафинов ряда C₁₂-C₁₈ в биопрепарате.

Для исследования срока сохранения жизнеспособности бактерий в биопрепарате, были изготовлены пробы с теми же веществами, но в различных весовых соотношениях, в заявляемых пределах. Состав биопрепарататов, наряду с описанными выше примерами, представлен в таблице. Для подтверждения увеличения срока сохранения жизнеспособности бактерий биопрепарата по отношению к прототипу были проведены соответствующие исследования титров бактерий. Результаты исследований представлены в этой же таблице.

Исследования показали, что оптимальная концентрация KCl в препарате для Mycobacterium phlei штамм 5КВ - 0,5%; для Pseudomonas aeniginosa штамм 4D и Rhodococcus species штамм 1АХ - 0,1% и 0,3% соответственно.

Как видно из таблицы, введение в биопрепарат хлористого калия, наряду с ЩКА и парафинами, позволяет сохранить высокий титр бактерий, то есть сохранить жизнеспособность бактерий препарата в течение не менее 3 мес (практически на уровне не менее 50% от исходного). Для сравнения в таблице приведены данные по препарату Нафток, титр которого через 3 мес составил 3% от исходного значения. Как показали исследования заявляемого препарата, сохранение высокого титра в течение долгого времени (срок хранения не менее 3 мес) является следствием того, что хлористый калий подавляет вредное воздействие продуктов жизнедеятельности бактерий на сами бактерии, сохраняя тем самым первоначальный титр.

Заявленный препарат применяется следующим образом.

Перед очисткой нефтезагрязненной почвы готовый препарат разводят водой максимально в соотношении 1:100. Полученный рабочий раствор препарата наносят на поверхность, например, путем опрыскивания или полива. Обработанную почву перепахивают на глубину 20-25 см с последующим 3-4-кратным культивированием в течение летне-осеннего сезона. Расход препарата зависит от степени загрязнения, и от вида нефтепродуктов и типа почвы и составляет 300-400 л на га.

Очистка загрязненных поверхности водоемов осуществляется в теплое время года при температуре воды не ниже 12°С (оптимальная температура в поверхностном слое воды - не ниже 20°С) путем опрыскивания.

Препарат действует более эффективно при спокойной воде и отсутствии сноса препарата.

Научно-производственная практика показала высокую эффективность заявленного биопрепарата. Степень очистки почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, составляет от 50 до 99,4% в зависимости от вида загрязнителя, его состава, содержания в почве и времени очистки. При высокой степени очистки нефтезагрязнение почвы, как показал мониторинг, может быть снижено до значения ПДК.

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Биопрепарат содержит, мас.%: нормальные парафины C₁₂-C₁₈ - 1,0-1,5, щавелевокислый аммоний - 0,05-0,1, хлористый калий - 0,1-0,5, водосодержащую культуральную жидкость на основе аэробных нефтеокисляющих бактерий - до 100. В качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий он содержит бактерии Mycobacterium phlei. Увеличение срока годности препарата до 3-х месяцев достигается за счет введения в препарат хлористого калия, который подавляет вредное воздействие продуктов жизнедеятельности бактерий на сами бактерии. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Биопрепарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов, характеризующийся тем, что содержит водосодержащую культуральную жидкость на основе аэробных нефтеокисляющих бактерий, нормальные парафины C₁₂-C₁₈, щавелево-кислый аммоний и хлористый калий при следующем соотношении компонентов, мас.%:
нормальные парафины C₁₂-C₁₈ 1,0-1,5 щавелево-кислый аммоний 0,05-0,1 хлористый калий 0,1-0,5 водосодержащая культуральная жидкость   на основе аэробных нефтеокисляющих бактерий остальное до 100

2. Биопрепарат по п.1, отличающийся тем, что в качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий он содержит бактерии Mycobacterium phlei штамм 5 KB в конечной концентрации не ниже 5·10⁹ клеток/мл препарата.