БИОПРЕПАРАТ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ И ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 2002 года по МПК C02F3/34 B09C1/10 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/01 C12N1/20 C12R1/32 

Изобретение относится к микробиологической очистке почв и водоемов при разливе нефти и нефтепродуктов, при очистке промышленных сточных вод, загрязненных нефтепродуктами и солями тяжелых металлов.

Проблема очистки водоемов и почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами является важной задачей биотехнологии защиты окружающей среды. Процесс самовосстановления загрязненных почв является очень длительным и может продолжаться более 25 лет, а в районах севера и до 50 лет. Интенсификация биологического разрушения углеводородов нефти в окружающей среде может быть достигнута за счет интродукции в загрязненную экосистему нефтеокисляющих микроорганизмов.

Известен биопрепарат "Путидойл" /1/, предназначенный для ускорения разложения нефти. Его недостатком является сложная технология приготовления препарата, которая предусматривает распылительную сушку живой культуры бактерий. Этот метод сушки не позволяет получить препарат с титром клеток более 10¹⁰кл/г вследствие инактивации клеток под действием высоких температур (+60^oС).

Существуют также публикации, указывающие на то, что в естественных условиях препарат "Путидойл" оказался малоэффективен и что он оказывает угнетающее воздействие на естественный микробный ценоз /2/.

Наиболее близок нашему биопрепарат "Нафтокс" /3/. Его недостатком является то, что бактерии препарата утилизируют только нормальные парафины нефти (С₁₂-С₁₈), а это 10-20% от состава нефти. В состав же нефти входят, кроме нормальных парафинов, нафтены, ароматические, полиароматические, непредельные, предельные, изопреноидные и другие углеводороды. Все они более токсичны для живой природы, чем нормальные углеводороды, и без их биодеструкции очистка от нефтезагрязнений будет незначительная.

Задачей предлагаемого изобретения является создание высокоэффективного биопрепарата (предполагаемое название "Лессорб-био"), обладающего высокой утилизирующей способностью по отношению к нефти и нефтепродуктам в широком диапазоне температур, который может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтью, нефтепродуктами и солями тяжелых металлов.

Поставленная задача решается созданием биопрепарата, содержащего аэробные нефтеокисляющие бактерии, органический субстрат, воду, причем в качестве органического субстрата он содержит сорбент "Лессорб", представляющий собой продукт обработки растительного материала, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Сорбент "Лессорб" - 17,5-10,5
Вода - Остальное
Аэробные нефтеокисляющие бактерии - в эффективном количестве (кл/г препарата)
В качестве нефтеокисляющих бактерий биопрепарат содержит штаммы бактерий: Mycobacterium flavescens ЕХ-91 /4/, Mycobacterium species ИЖ 4 /5/, Rhodo-coccus species 56 д /6/, Acinetobacter species HB-1 /7/, подобранные в соответствии с условиями очищаемой территории, а необходимое количество живых активных бактерий рассчитывается в зависимости от степени загрязнения.

Входящие в биопрепарат культуры непатогенны, нетоксичны и нетоксигенны.

Высокая эффективность биопрепарата обусловлена подбором штаммов бактерий:
-все штаммы обладают биоэмульгирующей активностью;
-в препарат входят быстро- и медленнорастущие бактерии, что обеспечивает быстроту и эффективность очистки;
-составляющие бактерии растут при температуре 4-10^oС, биодеградация нефти при этих температурах замедляется, но не прекращается, поэтому предлагаемый биопрепарат можно использовать для очистки нефтезагрязненных территорий в районах Севера;
- бактерии, входящие в состав биопрепарата, имеют устойчивость к некоторым веществам и солям тяжелых металлов:
М. flavescens EX-91 - Mn, Zn, Мо, Рb (100 мг/л), Сr (IV), Сr (VII), Fe (10 мг/л), Ni (5 мг/л), Аg (1 мг/л), Нg (0,05 мг/л), Сu (0,1 мг/л), фенол, формальдегид (100 мг/л).

Mycobacterium sp. ИЖ 4 - Ni, Fe (10 мг/л), Pb, Mo, Zn, Cu, Mn, Сr (IV), Сr (VII) -(1мг/л); фенол (100 мг/л).

Rhodococcus sp. 56д - Fe (10 мг/л), Pb, Ni, Mn, Сr (IV), Сr (VII) - (1 мг/л), Нg (0,05 мг/л), Zn (0,05 мг/л), фенол (100 мг/л).

Acinetobacter sp. HB-1 - Ni, Pb, Сr (VII)- (10 мг/л) -(0,5 мг/л), фенол (10 мг/л).

Сорбент "Лессорб " - продукт обработки растительного материала (мох, древесина, торф и т. д. ) /8/. Этот сорбент имеет высокую поглотительную способность по отношению к углеводородам нефти (8-10 кг/кг). Кроме того, он обладает также хорошей адсорбирующей способностью в отношении бактериальных клеток нефтеокисляющих штаммов (до 8•10⁹ кл/г).

Расход биопрепарата для обработки водоемов составляет 100-150 г/м², для обработки почвы -15-20 кг/т.

Срок хранения биопрепарата при температуре +4 - 10^oС - 6 месяцев, а при температуре 20^oС - 3 месяца.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Предлагаемый биопрепарат "Лессорб-био" получают путем нанесения клеток нефтеокисляющих бактерий на сухой сорбент "Лессорб", который перед использованием высушивают при температуре 105-110^oС в течение 3-4 ч до влажности 2%.

Микробную массу штаммов для этого выращивают каждый отдельно в ферментере АК-210 с контролем и поддержанием основных параметров культивирования (рН, t^o, парциальное давление растворенного O₂, скорость перемешивания, расход воздуха на аэрацию). Процесс культивирования заканчивают на стадии стационарной фазы. Затем культуральную жидкость концентрируют на микрофильтрационной установке МР-0,3. Концентрированную клеточную суспензию (10¹¹кл/мл) перемешивают с сорбентом в весовом отношении 7:1 соответственно.

Полученный влажный биопрепарат раскладывают на лотки и высушивают при комнатной температуре в течение 2 сут или продувкой воздуха (40^oС) над лотками в течение 2 ч до влажности 1-3%. Сухой биопрепарат раскладывают в полиэтиленовые мешки и запаивают. Срок хранения биопрепарата 6 месяцев в условиях холодильника и 3 месяца при комнатной температуре.

Пример 2. В колбочки на 100 мл вносят по 30 мл минеральной среды 8Е и 1% модельной нефти (нафталин, тетрадекан, пентадекан, гексадекан, фенилдекан, пристан, пирен, фенантрен, аценафтен), а также вносят 1% биопрепарата "Лессорб-био". Контрольную колбу оставляют без биопрепарата. Культивирование проводят на качалке при 200 об/мин, 20^oС в течение 5 дней. Обработку результатов проводят на газовом хроматографе. Результаты показывают, что биодеградация указанных углеводородов прошла на 85, 61, 60, 65, 39, 37, 23, 32, 42% соответственно.

Пример 3. В колбочки на 100 мл вносят по 30 мл минеральной среды 8Е, 300 мг нефти, 10 мг/л солей: Mn, Pb, Zn, Mo, Fe, Mi, Аg и Cr - 50 мкг/л и 1% биопрепарата "Лессорб-био". Контролем служит колба без солей, в которую вносят биопрепарат и нефть. Опыт проводят в трех повторностях. Культивируют колбы на качалке при 28^oС при 200 об/мин в течение 5 дней. Результаты опыта показывают, что в колбе с солями металлов и без них культуры биопрепарата утилизируют нефть на 67%.

Пример 4. На опытный участок дерново-подзолистой почвы (Московская область) площадью 0,25 м² равномерно наносят нефть из расчета 8 л/м² и биопрепарат "Лессорб-био" на глубину 20-25 см из расчета 150 г/кг почвы. Вместе с биопрепаратом вносят 0,75% нитроаммофоса, почву рыхлят культиватором 3-4 раза за сезон. Пробы отбирают через 1 и 3 месяца и анализируют на содержание углеводородов нефти. Результаты показывают, что углеводороды нефти были утилизированы через месяц на 26%, а через 3 - на 40%, в то время как самоочищение почвы за счет аборигенной микрофлоры за 1 месяц произошло на 8%, а через 3 месяца - на 18%.

Пример 5. Эксперимент поставлен аналогично примеру 4. В почву вносят 24 л/м² нефти. Результаты показывают, что углеводороды нефти были утилизированы через месяц на 48%, а через 3 - на 63%, в то время как самоочищение почвы за счет аборигенной микрофлоры за 1 месяц произошло на 12%, а через 3 месяца - на 22%.

Пример 6. Испытания биопрепарата "Лессорб-био" проводились на базе "Транснефть" г. Брянска. Технологию очистки земли проводили по следующей схеме. Сильно загрязненный (20%) нефтепродуктами грунт (песок, земля) загружали в реактор, куда также вносили воду (60%) и биопрепарат "Лессорб-био". Процесс очистки почвы биофлотацией в реакторе проводили для песка 4-5 ч, а для земли 15 ч. К этому времени очистка грунта от нефтепродуктов достигала 82-92%. Обработанный грунт подсушивали и в специальных емкостях добавляли нитроаммофос (0,75%). Почву регулярно рыхлили и поливали. В ходе биологической доочистки в течение 3 месяцев остаточные полютанты были утилизированы из песка до 93%, а в земле до 97%.

Таким образом, преимуществом предлагаемого биопрепарата "Лессорб-био" является то, что он эффективно и в короткий срок утилизирует ароматические, полиароматические, непредельные, изопреноидные углеводороды нефти, которые более канцерогенны и токсичны для живой природы по сравнению с предельными углеводородами. Кроме нефти предлагаемый биопрепарат эффективно утилизирует мазут, дизельное топливо, керосин. Культуры из предлагаемого биопрепарата устойчивы к ионам тяжелых металлов, фенолу и формальдегиду, что расширяет диапазон его применения при очистке территорий от нефти и нефтепродуктов.

Источники информации:
1. ТУ 64-16-75-91
2. Новиков Ю. В, Комзолова Н.В. Исследования бактериального препарата "Путидойл", предложенного для очистки водоемов от нефти.- Водное хозяйство, 1992, 2, с. 121-123.

3. Патент RU 2053205, 27.01.1996 г.

4. Патент RU 2053296, 27.01.1996 г.

5. Патент RU 2077578, 20.04.1997 г.

6. Патент RU 2101352, 10.01.1998 г.

7. Патент RU 2077579, 20.04.1997 г.

8. ТУ 9010-002-35615057-99 (Вводятся взамен ТУ 9010-001-35615057-94).

Изобретение относится к микробиологической очистке почв и водоемов при разливе нефти и нефтепродуктов, при очистке промышленных сточных вод, загрязненных нефтепродуктами и солями тяжелых металлов. Биопрепарат (коммерческое название "Лессорб-био") создан на основе нефтеокисляющих бактерий Mycobacterium flavescens ЕХ-91, Mycobacterium sp ИЖ4, Rhodococcus sp. 56д, Acinetobacter sp. НВ-1) и сорбента "Лессорб", представляющего собой продукт обработки растительного материала. Биопрепарат в короткий срок утилизирует ароматические, полиароматические, непредельные, изопреноидные углеводороды нефти, которые более канцерогенны и токсичны для живой природы по сравнению с предельными углеводородами. Кроме нефти предлагаемый биопрепарат эффективно утилизирует мазут, дизельное топливо, керосин. Культуры биопрепарата устойчивы к ионам тяжелых металлов, фенолу и формальдегиду. Биопрепарат непатогенен, нетоксичен, не загрязняет окружающую среду, срок хранения в условиях холодильника до 6 месяцев. 4 з.п.ф-лы.

1. Биопрепарат для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов, включающий аэробные нефтеокисляющие бактерии, органический субстрат, воду, отличающийся тем, что в качестве органического субстрата используют сорбент "Лессорб", представляющий собой продукт обработки растительного материала, при следующем соотношении компонентов, мас. %:
Сорбент "Лессорб" - 17,5-10,5
Вода - Остальное
Аэробные нефтеокисляющие бактерии - В эффективном количестве (кл/г препарата)
2. Биопрепарат по п. 1, отличающийся тем, что в качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий он содержит бактерии штамма Mycobacterium flavescens EX-91 в конечной концентрации не менее 5,0•10⁹ кл/г препарата. 3. Биопрепарат по п. 1, отличающийся тем, что в качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий он содержит бактерии штамма Mycobacterium sp. ИЖ 4 в конечной концентрации не менее 4,0•10⁹ кл/г препарата. 4. Биопрепарат по п. 1, отличающийся тем, что в качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий он содержит бактерии штамма Rhodococcus sp. 56д в конечной концентрации не менее 4,5•10⁹ кл/г препарата. 5. Биопрепарат по п. 1, отличающийся тем, что в качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий он содержит бактерии штамма Acinetobacter sp. НВ-1 в конечной концентрации не менее 9,0•10⁹ кл/г препарата.