БИОПРЕПАРАТ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ И ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 2002 года по МПК C02F3/34 B09C1/10 C12N1/26 C12N1/26 C12R1/01 C12N1/26 C12R1/32 

Изобретение относится к микробиологической очистке почв и водоемов при разливе нефти и нефтепродуктов, при очистке промышленных сточных вод, загрязненных нефтепродуктами и солями тяжелых металлов.

Проблема очистки водоемов и почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами является важной задачей биотехнологии защиты окружающей среды. Процесс самовосстановления загрязненных почв является очень длительным и может продолжаться более 25 лет, а в районах севера и до 50 лет. Интенсификация биологического разрушения углеводородов нефти в окружающей среде может быть достигнута за счет интродукции в загрязненную экосистему нефтеокисляющих микроорганизмов.

Известен бактериальный препарат "Путидойл" (ТУ 64-16-75-91), предназначенный для ускорения разложения нефти. Его недостатком является сложная технология приготовления препарата, которая предусматривает распылительную сушку живой культуры бактерий. Этот метод сушки не позволяет получить препарат с титром клеток более 10¹⁰ кл/г вследствие инактивации клеток под действием высоких температур (+60^oС).

Существуют также публикации, указывающие на то, что в естественных условиях препарат "Путидойл" оказался малоэффективен, и что он оказывает угнетающее воздействие на естественный микробный ценоз (Новиков Ю.В., Комзолова В.В. Исследования бактериального препарата "Путидойл", предложенного для очистки водоемов от нефти. - "Водное хозяйство", 1992, 2, с.121-123).

Наиболее близок предлагаемому бактериальный препарат "Нафтокс" (патент RU 2053206). Его недостатком является то, что бактерии препарата утилизируют только нормальные парафины нефти (С12-С18), а это 10-20% от состава нефти. В состав же нефти входят, кроме нормальных парафинов, нафтены, ароматические, полиароматические, непредельные, предельные, изопреноидные и другие углеводороды, все они более токсичны для живой природы, чем нормальные углеводороды, и без их биодеструкции очистка от нефтезагрязнений будет незначительная.

Задачей предлагаемого изобретения является создание высокоэффективного бактериального препарата (предлагаемое название "Экойл"), обладающего высокой утилизирующей способностью по отношению к нефти и нефтепродуктам в широком диапазоне температур, который может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтепродуктами и солями тяжелых металлов.

Поставленная задача решается созданием бактериального препарата, содержащего аэробные нефтеокисляющие бактерии, воду, а также сахарозу, полиэтиленгликоль и нефть при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Нефть - 0,5-1
Сахароза - 1-5
Полиэтиленгликоль - 1-5
Вода - Остальное
Аэробные нефтеокисляющие бактерии - В эффективном количестве (кл/мл препарата)
В состав предлагаемого препарата "Экойл" входят следующие культуры:
Mycobacterium flavescens ВКПМ В-6000, Mycobacterium ИЖ 4, Rhodococcus sp. 56д, Acinetobacter sp. HE-1 (защищенные патентами RU 2053296, 2077578, 2107578, 2077579 соответственно). Все культуры непатогенны, нетоксичны и нетоксигенны. Эффективность препарата обусловлена подбором штаммов бактерий:
- все штаммы обладают биоэмульгирующей и нефтеокисляющей активностью;
- в препарат входят быстро- и медленнорастущие бактерии, что обеспечивает эффективность и быстроту очистки;
- составляющие бактерии растут при температуре 4-10^oС, биодеградация нефти при этих температурах замедляется, но не прекращается, поэтому предлагаемый биопрепарат можно использовать для очистки нефтезагрязненных территорий в районах Севера;
- бактерии, входящие в состав биопрепарата, имеют устойчивость к некоторым веществам и солям тяжелых металлов:
М. flavescens ВКПМ B-6000-Mn, Zn, Mo, Рb (100 мг/л), Сr (IV), Сr (VII), Fe (10 мг/л), Ni (5 мг/л), Аg (1 мг/л), Нg (0,05 мг/л), Сu (0,1 мг/л), фенол, формальдегид (100 мг/л).

Mycobacterium sp. ИЖ 4 - Ni, Fe (10 мг/л), Pb, Mo, Zn, Cu, Mn, Cr (IV), Cr (VII) - (1 мг/л); фенол (100 мг/л).

Rhodococcus sp. 56д - Fe (10 мг/л), Pb, Ni, Mn, Cr (IV), Cr (VII) - (1 мг/л), Нg (0,05 мг/л), Zn (0,05 мг/л), фенол (100 мг/л).

Acinetobacter sp. HB-1- Ni, Pb, Сr (VII)- (10 мг/л), Cr (IV)- (0,5 мг/л), фенол (10 мг/л).

Оптимальной для интродукции в естественную экосистему клеток предлагаемого биопрепарата является концентрация 1•10⁷ кл/г почвы или 1•10⁷ кл/мл³ воды. Содержание в суспензии биопрепарата сырой нефти в количестве 0,5-1%, сахарозы 1-5% и полиэтиленгликоля 1-5% способствует сохранению жизнеспособности и нефтеокисляющей активности.

Срок хранения препарата при температуре от +4 до +8^oС - 1 месяц. Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Для культивирования нефтеокисляющих бактерий используют минеральную среду 8Е следующего состава, г/л: (NН₄)₂НРO₄ - 0,5; KH₂PO₄ - 0,7; NaCl - 0,5 MgSO₄ •7H₂O - 0,8; дрожжевой экстракт - 0,1; глюкоза - 10,0.

Микробную массу каждого штамма выращивают отдельно в ферментере АК - 2 К при рН 6-7 и температуре 28^oС со скоростью потока Д=0,04^-1. В результате получают культуральную жидкость с концентрацией живых клеток 20•10⁹ кл/мл. При необходимости уменьшения объема для дальнейшей транспортировки биопрепарата культуральную жидкость концентрируют на микрофильтрационной установке МР-0,3. Концентрированную клеточную суспензию (10¹¹ кл/мл) смешивают с 0,5% сырой нефти. В качестве стабилизатора вносят 5% полиэтиленгликоля, для сохранения жизнедеятельности бактерий вносят 5% сахарозы.

Приготовленный таким образом биопрепарат разводят до нужной концентрации и наносят путем опрыскивания на поверхность загрязненной почвы или воды. При необходимости вместе с биопрепаратом на обрабатываемую территорию наносят минеральные удобрения (аммофоска, 0,75%), а почву дополнительно известкуют до рН 7,0. Обработанную биопрепаратом почву культивируют 3-4 раза за летне-осенний сезон. При сильном загрязнении можно провести повторную обработку биопрепаратом. Культуры биопрепарата сохраняют в почве свою жизнедеятельность и после зимнего сезона, для ускорения рекультивации загрязненных почв их можно обработать и через год.

Пример 2. В колбочки на 100 мл вносят по 30 мл минеральной среды 8Е и 1% модельной нефти (нафталин, тетрадекан, пентадекан, гексадецен, фенилдекан, пристан, пирен, фенантрен, аценафтен). В колбы добавляют предлагаемый препарат с концентрацией бактерий 1•10⁷ кл/мл. Контрольную колбу оставляют без препарата.

Культивирование проводят на качалке при 200 об/мин, 28^oС в течение 5 дней. Обработку результатов проводят на газовом хроматографе. Результаты показывают, что биодеградация указанных углеводородов прошла на 77,8%, 53,3%, 56,2%, 63,9%, 42,1% и 43,7% соответственно.

Пример 3. В колбы на 100 мл вносят по 30 мл минеральной среды 8Е, 300 мг нефти, 10 мг/л фенола и солей Мn, Pb, Zn, Mo, Fe, Ni, Аg, Cr - 50 мкг/л и предлагаемый препарат с концентрацией бактерий 1•10⁷ кл/мл. Контролем служит колба без солей, в которую вносят нефть и препарат. Опыт проводят в трех повторностях. Культивируют колбы на качалке при 28^oС при 200 об/мин в течение 5 дней. Результаты опыта показывают, что в колбе с солями металлов и без них предлагаемый препарат утилизирует нефть на 51%.

Пример 4. На опытный участок дерново-подзолистой почвы (Московская область) площадью 0,25 м² равномерно наносят нефть из расчета 8 л/м² и суспензию препарата из расчета 1•10⁷ кл/г почвы. Вместе с биопрепаратом вносят 0,75% аммофоски, перегной (2%), почву рыхлят. Пробы отбирают и анализируют через 1 и 3 месяца, 1 год на содержание углеводородов нефти и на численность клеток внесенных микроорганизмов. Через 1 месяц углеводороды нефти были утилизированы на 40%, через 3 месяца - 52%, через год - 66-73%. Количество активных нефтеокисляющих бактерий составило через 1 мес. и 3 мес. -2•10⁷, а через год - 7•10⁶ кл/г почвы. Таким образом, клетки биопрепарата "Экойл" и через год продолжают утилизировать углеводороды нефти, еще оставшиеся в почве.

Пример 5. В колбочки на 100 мл вносят по 30 мл минеральной среды и отдельно в каждую 300 мг нефти, мазута или керосина. В колбы вносят предлагаемый препарат до концентрации 1•10⁷ кл/мл. Колбы культивируют на качалках при 200 об/мин при 10 и 28^oС в течение 10 дней. Биодеградацию определяют на газовом хроматографе. Данные эксперимента показывают, что предлагаемый препарат при 10^oС утилизирует нефть, мазут, дизельное топливо и керосин соответственно 24, 12, 41 и 51%, а при 28^oС соответственно 72, 26, 74 и 95%.

Пример 6. Были проведены испытания препарата "Экойл" на территории Бахметьевского промысла в ПО "Нижневолжскнефть", где очищали водоем, загрязненный нефтью в результате аварийного разлива нефтепровода. Испытания проводили с сентября 1992 г. по май 1993 г. Суспензию препарата с концентрацией бактерий 6•10⁶ кл/см² разбрызгивали на поверхность загрязненного водоема, где толщина нефтяной пленки была около 5 мм. Через 2 месяца загрязненность водоема составляла 0,06%, а через 8 мес. - 0,0001%, что не превышает ПДК для нефти в водоемах.

Таким образом, преимуществом предлагаемого препарата "Экойл" по сравнению с аналогичным препаратом "Нафтокс", который утилизирует только нормальные углеводороды нефти, является то, что он эффективно и в короткий срок утилизирует ароматические, полиароматические, непредельные, изопреноидные углеводороды нефти, которые более канцерогенны и токсичны для живой природы по сравнению с предельными углеводородами. Кроме нефти предлагаемый препарат эффективно утилизирует мазут, дизельное топливо, керосин, как при температуре 28^oС, так и при 10^oС. Культуры из биопрепарата устойчивы к ионам тяжелых металлов, фенолу и формальдегиду, что расширяет диапазон его применения при очистке территорий от загрязнений нефтью и нефтепродуктами.

В состав бактериального препарата, имеющего коммерческое название "Экойл", входят аэробные нефтеокисляющие бактерии Mycobacterium, Rhodococcus и Acinetobacter, сахароза, полиэтиленгликоль, нефть и вода. Препарат обладает высокой утилизирующей способностью по отношению к нефти, мазуту, керосину, дизельному топливу, нафталину, пентадекану, тетрадекану, гексадецену, фенилдекану, пирену, пристану, фенантрену, аценафтену в широком диапазоне температур и может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтепродуктами и солями тяжелых металлов из-за устойчивости культур препарата к ионам тяжелых металлов: Cu, Ag, Mn, Ni, Zn, Mo, Pb, Fe, Cr; а также к фенолу и формальдегиду. Биопрепарат не токсичен, не загрязняет окружающую среду, срок хранения в условиях холодильника до 1 месяца. 4 з.п. ф-лы.

1. Биопрепарат для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов, включающий аэробные нефтеокисляющие бактерии и воду, отличающийся тем, что он дополнительно содержит нефть, сахарозу и полиэтиленгликоль, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Нефть - 0,5-1
Сахароза - 1-5
Полиэтиленгликоль - 1-5
Вода - Остальное
Аэробные нефтеокисляющие бактерии - В эффективном количестве (кл/мл препарата). 2. Биопрепарат по п.1, отличающийся тем, что в качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий он содержит бактерии Mycobacterium flavescens ВКПМ В-6000 в конечной концентрации не менее 1,2•10⁷ кг/мл препарата. 3. Биопрепарат по п.1, отличающийся тем, что в качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий он содержит бактерии Mycobacterium sp. ИЖ 4 в конечной концентрации не менее 2,5•10⁷ кл/мл препарата. 4. Биопрепарат по п.1, отличающийся тем, что в качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий он содержит бактерии Rhodococcus sp. 56д в конечной концентрации не менее 2•10⁷ кл/мл препарата. 5. Биопрепарат по п.1, отличающийся тем, что в качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий он содержит бактерии Acinetobacter sp. НВ-1 в конечной концентрации не менее 5•10⁷ кл/мл препарата.