СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ГЕМОГЛОБИНА В КРОВИ, РЕАКТИВ-КОМПЛЕКСООБРАЗОВАТЕЛЬ И РАСТВОР-КАЛИБРАТОР ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Российский патент 1996 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в гематологии при проведении исследований крови.

Известен способ определения концентрации гемоглобина в крови, согласно которому содержащиеся в крови различные формы гемоглобина трансформируют к одному устойчивому продукту метгемоглобинцианиду (гемиглобинцианиду), а концентрацию гемоглобина определяют по результатам измерения оптической плотности этого продукта. Недостатком указанного способа является необходимость использования токсичных трансформирующих агентов (цианистый калий или ацетонциангидрин).

Известен наиболее близкий к заявляемому способу определения концентрации гемоглобина в крови, включающий обработку пробы крови реактивом комплексообразователем, выполняющим функции гемолитика и трансформирующего агента, измерение оптической плотности полученного продукта в области длины волны 540 нм, при этом в качестве реактива-комплексообразователя используют додецилсульфат натpия, а концентрацию гемоглобина определяют расчетным путем, используя известное значение коэффициента экстинкции, связывающего значение оптической плотности с концентрацией гемоглобина. Недостатком известного способа является низкая точность определения концентрации гемоглобина, что обусловлено следующими обстоятельствами:
результаты измерения оптической плотности в области длины волны 540 нм содержат ошибку, вызванную присутствием в растворе рассеивающих свет частиц;
экспериментально установлено, что спектр поглощения получаемого конечного продукта имеет неизменную форму, если значение показателя рН реактива находится в пределах 7-8, а в случае выхода значения рН за указанные пределы спектр конечного продукта претерпевает значительные изменения, что ухудшает точность определения концентрации гемоглобина;
также экспериментально установлено, что при температурах ниже нормальной в растворе додецилсульфата натрия происходит его преципитация (осаждение), что снижает химическую активность реактива.

К ухудшению точности приводит также и то, что значение концентрации гемоглобина определяют умножением измеренного значения оптической плотности на значение коэффициента экстинкции, которое принимают равным 9860. Однако действительное значение коэффициента, характеризующего связь измеренного значения оптической плотности с концентрацией гемоглобина, может существенно отличаться от указанного значения в силу того, что условия измерений отличаются от тех условий, в которых было определено это значение (различные длины оптического пути используемых кювет, различные значения спектральных характеристик используемых фотометров, отличия в составе и концентрациях дозируемых веществ, приводящие к отличиям в свойствах конечного продукта, отличия в характеристиках используемых мер вместимости и т.д.). Последний недостаток может быть устранен, если перед определением концентрации гемоглобина проводят определение калибровочного коэффициента на том же оборудовании и с теми же реактивами, используя для этого раствор-калибратор с известным значением концентрации гемоглобина. При определении концентрации гемоглобина известным способом в качестве раствора-калибратора используют раствор гемиглобинцианида, однако в случае использования реактива-комлексообразователя на основе додецилсульфата натрия получаемый конечный продукт имеет форму спектра, отличную от формы спектра гемиглобинцианида, что не позволяет использовать раствор гемиглобинцианида в качестве раствора-калибратора.

Изобретение направлено на повышение точности определения концентрации гемоглобина в крови.

Сущность изобретения заключается в том, что в способе определения концентрации гемоглобина, включающем обработку пробы крови реактивом-комплексообразователем на основе додецилсульфата натрия и определение концентрации гемоглобина по результатам измерения оптической плотности полученного продукта, согласно изобретению измерение оптической плотности проводят в области длины волны 413 нм.

Реактив-комплексообразователь, включающий додецилсульфат натрия, согласно изобретению дополнительно содержит буферный агент для поддержания значения показателя рН в пределах 7-8.

Кроме того, реактив-комплексообразователь может дополнительно содержать неионное поверхностно-активное вещество, в качестве которого может быть использован Тriton X-100.

Раствор-калибратор с известной концентрацией гемоглобина содержит согласно изобретению раствор гемиглобинцианида в реактиве-комплексообразователе на основе додецилсульфата натрия.

Измерение оптической плотности в области длины волны 413 нм обусловлено тем, что, во-первых, был экспериментально обнаружен явно выраженный максимум поглощения на данной длине волны, и, во-вторых, также экспериментально была обнаружена высокая корреляция между результатами определения концентрации гемоглобина предложенным и известным референтным способами. При этом измерение оптической плотности в области длины волны 413 нм позволяет уменьшить ошибку, связанную с рассеянием света на рассеивающих частицах, так как значение оптической плотности при фотометрировании на этой длине волны существенно выше, чем на длине волны 540 нм, при одном и том же вкладе указанного рассеяния.

Использование буферного агента позволяет поддерживать значение показателя рН в пределах 7-8, при которых спектр поглощения конечного продукта имеет неизменную форму.

Использование неионного поверхностно-активного вещества, как было установлено экспериментально, предотвращает преципитацию додецилсульфата натрия в широком диапазоне рабочих температур и позволяет использовать реактив с высоким содержанием додецилсульфата натрия, что повышает его химическую активность.

Как установлено экспериментально, предложенный раствор-калибратор имеет спектр, совпадающий по форме со спектром конечного продукта, получаемого в результате обработки крови используемым реактивом-комплексообразователем, что позволяет повысить точность определения концентрации гемоглобина путем проведения калибровки непосредственно перед измерениями.

На фиг. 1 представлен спектр поглощения получаемого конечного продукта; на фиг. 2 корреляционная зависимость между результатами определения концентрации гемоглобина предложенным и известным референтным способами.

Способ осуществляют следующим образом. К пробе крови добавляют реактив-комплексообразователь, через 30 с измеряют оптическую плотность Е раствора в области длины волны 413 нм, а концентрацию Нb гемоглобина определяют из соотношения:
Hb E · K · N, где К коэффициент разведения крови;
N градуировочный коэффициент.

Градуировочный коэффициент определяют, измеряя на указанной длине волны, в тех же условиях и на том же оборудовании оптическую плотность Е_о раствора-калибратора, получаемого добавлением реактива-комплексообразователя на основе додецилсульфата натрия к гемиглобинцианиду (или хлорогемину), из соотношения:
N C/E_o, где С эквивалентная концентрация гемоглобина в растворе-калибраторе.

Для приготовления раствора-калибратора может быть использован гемиглобинцианид, промышленно выпускаемый в растворе с точно известной эквивалентной концентрацией гемоглобина (1 г/л), или хлорогемин, приготавливаемый в лабораторных условиях. Преимуществом последнего является способность хлорогемина длительно храниться в сухом виде с возможностью приготовления раствора-калибратора весовым методом непосредственно перед калибровкой.

В таблице приведен пример количественного состава предложенного реактива-комплексообразователя.

Концентрация додецилсульфата натрия должна быть не менее пороговой величины 0,8 г/л, при которой возможно проведение реакции за время, не превышающее 30 с.

Результаты проведенных экспериментальных исследований подтверждают высокую точность определения концентрации гемоглобина в крови с использованием предложенных способа, реактива-комплексообразователя и раствора-калибратора. Коэффициент корреляции результатов определения концентрации гемоглобина предложенным и известным референтным способами составляет не менее 0,95.

Использование: в медицине, в гематологии для определения концентрации гемоглобина в крови. Сущность изобретения: способ включает обработку крови реактивом-комплексообразователем на основе додецилсульфата натрия и определение концентрации гемоглобина по результатам измерения оптической плотности получаемого продукта в области длины волны 413 нм. Реактив-комплексообразователь включает додецилсульфат натрия и буферный агент, поддерживающий значение показателя рН в пределах 7-8. Кроме того, в состав реактива может входить неионное поверхностно-активное вещество для определения калибровочного коэффициента, связывающего измеряемое значение оптической плотности с концентрацией гемоглобина в получаемом продукте, используют раствор- калибратор с известной концентрацией гемоглобина. В качестве раствора-калибратора используют раствор гемиглобинцианида (или хлорогемина) в указанном реактиве - комплексообразователе. Использование изобретения позволяет с высокой точностью производить определение концентрации гемоглобина. 3 с. и 3 з. п. ф-лы, 2 ил., 1 табл.

1. Способ определения концентрации гемоглобина в крови, включающий обработку пробы крови реактивом-комплексообразователя на основе додецилсульфата натрия и определение концентрации гемоглобина по результатам измерений оптической плотности полученного продукта, отличающийся тем, что используют реактив-комплексообразователь, имеющий значение рН в пределах 7 - 8, измерение оптической плотности проводят в области длины волны 413 нм, а концентрацию гемоглобина (HB) определяют из соотношения
HB = E • K - N,
где K - коэффициент разведения крови;
E - измеренное значение оптической плотности;
N - калибровочный коэффициент. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что калибровочный коэффициент определяют по результатам измерений на указанной в п.1 длине волны оптической плотности раствора калибратора (Е₀) из соотношения

где C - эквивалентная концентрация гемоглобина в растворе-калибраторе. 3. Реактив-комплексообразователь, включающий додецилсульфат натрия, отличающийся тем, что он дополнительно содержит буферный агент для поддержания значения показателя рН в пределах 7 - 8. 4. Реактив-комплексообразователь по п.2, отличающийся тем, что он дополнительно содержит неионное поверхностно-активное вещество. 5. Реактив-комплексообразователь по п. 3, отличающийся тем, что в качестве неионного поверхностно-активного вещества он содержит Triton Х-100. 6. Раствор-калибратор с известной концентрацией гемоглобина, отличающийся тем, что он содержит раствор гемиглобинцианида или хлорогемина в реактиве-комплексообразователе на основе додецилсульфата натрия.