Способ количественной и электрофоретической оценки содержания белков в моче Российский патент 2024 года по МПК G01N33/48 G01N33/68 

Изобретение относится к области медицины, может использоваться в клинико-диагностической практике с целью: концентрирование белка в моче, определение содержания белка в моче, способ пробоподготовки для электрофоретического разделения белков мочи, способ окрашивания полученных электрофореграмм.

Наибольшее распространение определения белка в моче получил метод с сульфосалициловой кислотой (ССК). Метод основан на помутнении пробы с образованием хлопьевидных преципитатов вследствие денатурации белков в кислой среде [Kingsbury F.B., Clark C.P., Williams G., Post A.L. // J. Lab. Clin. Med. – 1926. – Vol. 11. – P.981-989]. Процедура определения белка состоит в добавлении к пробе ССК, с последующей инкубацией 5 минут, после чего концентрацию белка определяют по интенсивности помутнения на фотоэлектроколориметре против холостой пробы, расчеты проводят с помощью калибровочного графика, построенного по стандартным растворам альбумина. Однако определение белка с ССК более специфично к альбумину и в присутствии глобулинов общее содержание белка получается заниженным. Кроме того, несмотря на простоту выполнения анализа, доступность реактива и экономичность, метод имеет ряд существенных недостатков: плохо поддается стандартизации; существенное различие в составе калибратора (альбумин) и проб приводит к заниженным результатам; малая чувствительность метода (недостаточно для диагностики микропротеинурии); малая степень разведения пробы в реагенте 1/3 приводит к сильному влиянию в реакционной смеси интерферирующих веществ.

Наиболее чувствительными и точными являются колориметрические методы определения общего белка мочи, основанные на специфических цветных реакциях белков, в частности методы, основанные на связывании белка с органическими красителям. Наиболее широко применяемые методы с кумасси бриллиантовым голубым и пирогаллолово-красным (ПГК).

Способ количественного определения содержания белка, основанный на связывании белков красителем Coomassie Briliant Blue G-250 [Bradford M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem, 1976. V. 72. P. 248 – 254.]. В кислой среде сульфонильные группы анионной формы красителя соединяются с белком, максимум поглощения свободной формы красителя при 495 нм, после связывания с белком при 595. Комплекс белок-краситель образуется в течение 2 минут и сохраняет стабильность около 1 часа, Изменение окраски регистрируют фотометрически при длине волны 595 нм через 2-3 минуты после реакции, расчеты проводят с помощью калибровочного графика, построенного по стандартным растворам альбумина. Метод простой, быстрый и недорогой, чувствительность составляет 5 – 15 мг/л, но линейная область определения белка приблизительно 500 мг/л. Краситель нечувствителен к большинству компонентов буферных смесей, но подвержен влиянию детергентов: додецилсульфат натрия, тритон X-100. Помимо этого, результат анализа может искажать неоднородная способность красителя связывать белки: связывание происходит преимущественно с аминокислотными остатками аргинина и в меньшей степени гистидина, триптофана, тирозина, лизина и фенилаланина.

Способ количественного определения содержания белка, основанный на связывании комплекса красителя пирогаллоловый красный и ионов молибдата с молекулами белка в кислой среде [Watanabe N., Kamei S., Ohkubo A., Yamanaka M., Ohsawa S., Makino K., Tokuda K. Urina Protein as Measured with a Pyrogallol Red-Molybdate Complex, Manually and in a Hitachi 726 Automated Analyzer // Clin. Chem., 1986. V. 32 (8). P. 1551 – 1544.]. В кислой среде пирогаллоловый красный и молибдат натрия образуют комплекс с максимум поглощения при 460 нм, при взаимодействии комплекса с белками максимум поглощения смещается на 598 нм. Время необходимое для образования комплекса 10 минут, окраска остается стабильной в течение 1 часа. Изменение окраски регистрируют фотометрически при длине волны 600 нм через 10 минут после реакции, расчеты проводят с помощью калибровочного графика, построенного по стандартным растворам альбумина. Метод прост и удобен для ручного выполнения, также возможна автоматизация. Чувствительность метода составляет 30 – 40 мг/л, линейная область измерения от 0,05 до 2 г/л. Кроме того, сродство ПГК практически одинаково ко всем белкам. Образующиеся комплексы белок – краситель нечувствительны к большинству интерферирующих веществ. Помимо этого, в зависимости от используемой методики соотношение проба реагент варьирует от 1/10 до 1/50, что также уменьшает влияние присутствующих веществ в моче.

На основе протокола количественного определения содержания белка с красителем пирогаллоловым красным был разработан протокол [Caldwell R.B., Lattemann C.T. Simple and Reliable Method To Precipitate Proteins from Bacterial Culture Supernatant // Applied and environmental microbiology, 2004. V. 70. №.1. P. 610 – 612] концентрирования белка. Способ включает смешивание раствора реагента с белком с последующей инкубацией в течение ночи при +4˚С. После осадок центрифугируют при 10000 g в течение 1 часа, отделяют от супернатанта, промывают осадок 1 мл ацетона и удаляют ацетон выпариванием.

Наиболее близким к изобретению является способ количественного определения белка в биологических жидкостях (моче и спинномозговой жидкости) с применением коммерческого набора «Белок PGR» производства компании «Абрис+». Способ включает смешивание раствора реагента с образцом биологической жидкости в соотношении 50:1, инкубацию пробы с перемешиванием в течение 10 минут, измерение оптической плотности против холостой пробы при длине волны 600 нм и определение концентрации белка по стандартной формуле относительно калибровочного раствора альбумина. В составе набора пирогаллоловый красный – 0,6 ммоль/л, молибдат натрия – 1,6 ммоль/л, сукцинат натрия – 50 ммоль/л, в результате взаимодействия белковых молекул с пирогаллоловым красным в кислой среде в присутствии ионов молибдата образуется окрашенный комплекс, имеющий максимум поглощения при длине волны 613 нм.

Однако коммерческих наборов с протоколом для одномоментного применения, как в качестве способа определения концентрации белка, так и способа концентрирования, а также с возможностью использования в качестве красителя электрофореграмм, не было найдено.

Техническим результатом изобретения является улучшение аналитических характеристик, чувствительность способа составляет 0,05 г/л, область линейности до 2 г/л, коэффициент вариации менее 10%, выход белка при концентрировании до 56-79%.

Сущность предложенного способа состоит в том, что для определения концентрации белка указанным способом, включающим смешивание образца с реактивом-комплексообразователем, инкубацию пробы в течение 10 минут при комнатной температуре, измерение оптической плотности пробы фотометрически при длине волны 600 нм, определение концентрации белка стандартным образом, используют реагент (PRMM) следующего состава: пирогаллоловый красный (0,05 ммоль/л), молибдат натрия (0,16 ммоль/л), сукцинат натрия (50 ммоль/л), оксалат натрия (1 ммоль/л), 20% (vol/vol) метанол в воде. Концентрирование белка в пробе достигается путем последующей инкубации при +4˚С в течение суток, после центрифугируют при 12000 об/мин 11 минут и отбирают супернатант.

Смешивание биологической жидкости с реактивом-комплексообразователем ведут в соотношении 1:9, при этом измерение оптической плотности проводят при одной длине волны 600 нм. Выбранное соотношение проба-реагент является компромиссным решением и для измерения концентрации белка, и для последующего концентрирования.

Реактив-комплексообразователь, кроме молибдата натрия и пирогаллолового красного включает метанол в качестве низкоатомного спирта. Это позволяет стабилизировать раствор реактива во время приготовления и при дальнейшем хранении. Кроме того, введение именно метанола повышает количественный выход белка при концентрировании.

Введение в реактив-комплексообразователь янтарной кислоты позволяет повысить его буферную емкость.

Введение в реактив-комплексообразователь оксалата натрия позволяет уменьшить влияние интерферирующих факторов при определении концентрации белка в моче.

Реактив-комплексообразователь готовят следующим образом: приготоавливают раствор окрашенного реагента – пирогаллолового красного в присутствии молибдата натрия, сукцината натрия и оксалата натрия растворением соответсвующих сухих навесок в дистиллированной воде, после чего добавляют метанол и доводят водой до нужного объема. Раствор для разведения готовят аналогичным образом без добавления пирогаллолового красного. Рабочий реактив готовят смешиванием необходимого объема в соотношении 1:1 окрашенного раствора и раствора для разведения.

Возможность практического применения заявленного способа иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Нормальное значения содержания общего белка в моче варьирует в диапазоне 10 – 140 мг/л [Tiez N.W. Clinical guide to laboratory tests // W.B. Saunders Company, 1986, p.87]. При диагностике микропротеинурии и протеинурии при различных почечных заболеваниях количественно определяют концентрацию общего белка в моче. Процедура определения следующая: в пробирку вносят 100 мкл образца мочи пациента и 900 мкл реактива. Проба инкубируется в течение 10 минут при комнатной температуре (+18…+25˚С). Далее проводится измерение фотометрическим способом на измерительном приборе в кювете с оптическим путем 1 см и при длине волны 600 нм против холостой пробы. В качестве холостой пробы используют раствор, состоящий из 100 мкл воды и 900 мкл реагента. Аналогичным образом проводят анализ стандартного водного раствора альбумина с концентрацией 1 г/л (калибровочный раствор). По полученным значения оптических плотностей для исследуемого образца (ОПоб) и калибровочного раствора альбумина (ОПкл) рассчитывают концентрацию С, г/л, белка в моче по формуле:

С = Cкл х (ОПоб/ОПкл), где Скл = 1 г/л.

В случае, если расчетная величина концентрации белка превышает 2 г/л, необходимо развести образец мочи пациента водой и провести анализ повторно, а полученный результат умножить на степень разведения.

Пример 2. Исследование белкового спектра мочи часто требует концентрирования белка в образце. Процедура концентрирования с PRMM следующая: в пробирку вносят 100 мкл образца мочи пациента и 900 мкл реактива, проба инкубируется в течение суток при +4˚С. После проводят центрифугирование при 12000 об/мин в течение 11 минут и отбирают супернатант, полученные осадки используются для электрофоретического разделения. При количественной оценке выход белка составил 56-79%, такой выход белка сопоставим с выходом достигаемым другими методами [Afkarian M., Bhasin M., Dillon S.T., Guerrero M.C., Nelson R.G., Knowler W.C., Thadhani R., Libermann T.A. (2010) Mol. Cell Proteomics, 9(10), 2195–2204. DOI:10.1074/mcp.M110.000992].

Пример 3. Электрофорез белков мочи с окраской электрофоретических пластинок PRMM. Определение белка и концентрирование проводят, как описано в примерах 1-2. Электрофорез проводят по Лэммли на 4-20% гелях Mini-PROTEAN TGX Precast Gels BioRad. После электрофоретического разделения проводят: фиксацию белков в электрофоретической пластине; окраску, помещая электрофоретическую пластину в рабочий раствор реактива на сутки; отмывку от избытка краски; сканирование. Качественная оценка электрофореграмм показывает, что интенсивность фракций при окраске PRMM несколько уступает Кумасси R-250. Однако фоновое окрашивание при использовании PRMM практически отсутствует (фиг. 1). Количественная оценка зависимости площади полосы на электрофореграмме от количества нанесенного белка (фиг. 2) показала, что для Кумасси эта зависимость носит выраженный экспоненциальный характер. В то же время, при окраске PRMM – зависимость линейна (R²=0,98). А преимущество Кумасси по коэффициенту чувствительности (наклон прямой при линейной аппроксимации) выражено только при малых количествах белка (7905 у.е./мкг до 1 мкг на дорожку, фиг. 2). При больших количествах белка на дорожку – коэффициенты чувствительности для обоих методов окрашивания примерно равны.

Таким образом, преимуществами предложенного изобретения в сравнении с известными решениями являются:

1) возможность более широкого практического применения реактива благодаря улучшенным аналитическим характеристикам, чувствительность способа составляет 0,05 г/л, область линейности до 2 г/л, коэффициент вариации составляет менее 10%;

2) возможность концентрирования белка перед электрофоретическим разделением благодаря модификации состава компонентов;

3) возможность применения реактива в качестве окраски гелей после электрофореза.

Краткое описание чертежей.

Фиг 1. Результаты ДСН-ПААГ электрофореза сконцентрированных проб: окрашивание PRMM и Кумасси R-250.

Фиг. 2. Зависимость площади пика на электрофореграмме от количества белка, нанесенного на дорожку при окрашивании Кумасси R-250 и реагентом PRMM.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ исследования белкового состава в биологических жидкостях. Способ включает смешивание образца мочи с раствором реагента, измерение оптической плотности раствора фотометрически относительно холостой пробы и расчет содержания белка по калибровочному раствору. Количественное определение концентрации белка включает смешивание в соотношении 1:9 образца биологической жидкости с реактивом-комплексообразователем, содержащим пирогаллоловый красный 0,05 ммоль/л, молибдат натрия 0,16 ммоль/л, сукцинат натрия 50 ммоль/л, оксалат натрия 1 ммоль/л, 20% vol/vol метанол в воде, инкубацию пробы в течение 10 минут при комнатной температуре, измерение оптической плотности пробы фотометрически при длине волны 600 и определение концентрации белка. Техническим результатом изобретения является улучшение аналитических характеристик, чувствительность способа составляет 0,05 г/л, область линейности до 2 г/л, коэффициент вариации менее 10%, выход белка при концентрировании до 56-79%. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 пр.

1. Способ исследования белкового состава в биологических жидкостях, включающий:

а) количественное определение концентрации белка в биологических жидкостях, концентрирование белка и определение качественного состава при электрофоретическом разделении белков (окраска электрофореграмм), где количественное определение концентрации белка включает смешивание в соотношении 1:9 образца биологической жидкости с реактивом-комплексообразователем, содержащим пирогаллоловый красный 0,05 ммоль/л, молибдат натрия 0,16 ммоль/л, сукцинат натрия 50 ммоль/л, оксалат натрия 1 ммоль/л, 20% vol/vol метанол в воде, инкубацию пробы в течение 10 минут при комнатной температуре, измерение оптической плотности пробы фотометрически при длине волны 600 и определение концентрации белка,

б) концентрирование белка в пробе достигается путем смешивания образца с реактивом-комплексообразователем в соотношении 1:9 и последующей инкубации при +4˚С в течение суток, после пробы центрифугируют при 12000 об/мин 11 минут и отбирают супернатант,

с) окраску электрофореграмм путем помещения электрофоретической пластины в рабочий раствор реактива на сутки.

2. Способ отличается тем, что в качестве низкоатомного спирта содержит метанол, что позволяет дополнительно использовать реагент как способ концентрирования белка в биологических жидкостях.