НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ГЕМОГЛОБИНА В КРОВИ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/72 G01N33/52 

Изобретение относится к области медицины и биохимии и может быть использовано для определения концентрации гемоглобина в крови.

Гемоглобин, относящийся к классу хромопротеидов, состоит из бесцветного белка, глобина, и связанной с ним простетической группы - окрашенного железопорфиринового комплекса гема. Именно гем, придающий гемоглобину характерный алый цвет, является важнейшим объектом спектрофотометрического анализа, который лежит в основе большинства методов количественного определения гемоглобина.

Для измерения гемоглобина в крови были разработаны различные способы, основанные на исследовании окрашенного железопорфиринового комплекса - гема: способ Сали, сапониновый способ, пиридин-гемохромогенный способ (Кушаковский М.С. Клинические формы повреждения гемоглобина. - 1968).

Основным недостатком способа Сали является недостаточная точность из-за влияния белков плазмы на реакцию между гемоглобином и соляной кислотой, а также из-за влияния билирубина, освещения, изменения со временем цвета стандартных растворов солянокислого гематина. Суммарная ошибка при использовании способа Сали доходит до 30%. При использовании сапонинового способа не растворяются тельца Гейнца, гемолизат остается мутным, а спектр раствора может изменяться. Пиридин-хромогенный способ дает заниженные результаты.

Наиболее распространенным и унифицированным для определения содержания гемоглобина в крови является гемиглобинцианидный способ, согласно которому содержащиеся в крови различные формы гемоглобина трансформируют к одному устойчивому продукту - гемиглобинцианиду, а концентрацию гемоглобина определяют по результатам измерения оптической плотности этого продукта (Drabkin D. L. Bibl. haemat., Basel, Fasc.21). В процессе измерения используют набор реагентов, включающий трансформирующий агент и калибратор. Трансформирующий реагент содержит железосинеродистый калий, цианид натрия и натрий углекислый кислый. Железосинеродистый калий окисляет все формы гемоглобина в метгемоглобин, который образует с цианидом натрия окрашенный в красно-коричневый цвет прозрачный раствор гемиглобинцианида. Калибратор содержит раствор гемиглобинцианида с точно установленной концентрацией. Недостатком известного набора является использование в нем токсичного компонента - цианида натрия.

Наиболее ближайшим к заявленному набору - прототипом, является набор реагентов для определения концентрации гемоглобина в крови (Патент РФ N 2044319, кл. C 01 N 33/48, опубл. 20.09.95, Бюл. N 26), включающий реагнт-комплексообразователь и калибратор. Реагент-комплексообразователь содержит, мас.%:
Додецилсульфат натрия - 0,03 - 0,15
Хлорид натрия - 0,9
Вода - Остальное
pH реагента - 7-7,5
Калибратор содержит известное количество гемоглобина, растворенного в реагенте-комплексообразователе, включающем додецилсульфат натрия. Способ измерения концентрации гемоглобина заключается в следующем: пробы крови обрабатывают реагентом-комплесообразователем, включающим додецилсульфат натрия, который трансформирует все формы гемоглобина в гемихром, имеющий в растворе красно-коричневый цвет, измеряют оптическую плотность раствора на двух различных длинах волн, значения которых находятся в области 550-595 нм, определяют значение содержания гемоглобина по результатам этих измерений. Допустимая ошибка определения гемоглобина при использовании известного набора реагентов составляет ± 2%.

Недостатками известного набора реагентов является:
- недостаточная стабильность реагентов при хранении;
- необходимость проведения измерений оптической плотности раствора на двух различных длинах волн (550-595 нм).

Технической задачей предлагаемого изобретения является повышение стабильности набора реагентов для определения содержания гемоглобина в крови при сохранении высокой точности определения последнего.

Поставленная задача достигается предлагаемым набором реагентов, включающим реагент-комплексообразователь и калибратор, при этом реагент-комплексообразователь дополнительно содержит азид натрия, а калибратор дополнительно содержит тимеросал, взятые в экспериментально подобранных оптимальных концентрациях.

Предлагаемый набор реагентов включает реагент-комплексообразователь, содержащий 0,03-0,15% додецилсульфата натрия (SDS), 0,0003-0,001% азида натрия и воду (остальное), pH реагента 7-8, и калибратор гемихрома, содержащий известное количество гемоглобина в реагенте-комплексообразователе, 0,03-0,08% тимеросала и воду(остальное), pH калибратора 7-8.

Допустимая ошибка определения концентрации гемоглобина с использованием заявляемого набора реагентов составляет 1-2%.

Включение в состав реагента-комплексообразователя нового компонента - азида натрия позволяет повысить стабильность реагента и продлить срок его годности до 2-х лет, а срок годности рабочего раствора реагента продлить до 8 месяцев. Использование азида натрия в количестве менее 0,0003% не позволяет добиться повышенной стабильности реагента-комплексообразователя, а использование азида натрия в количестве более 0,001% экономически нецелесообразно, так как не обеспечивает дальнейшего повышения стабильности реагента-комплексообразователя.

Включение в состав калибратора тимеросала (этиленмеркуртиосалициловой кислоты натриевая соль) позволяет стабилизировать комплекс гемихрома за счет содержащихся в препарате S-связей. Тимеросал в количестве 0,03-0,08% обеспечивает стабильность калибратора до 12 месяцев.

Значение водородного показателя (pH) реагента-комплексообразователя и калибратора находится в пределах 7-8, что и требуется для получения стабильного спектра конечного продукта (гемихрома).

Для приготовления раствора калибратора используют очищенную эритроцитарную массу, к которой добавляют рассчитанный объем воды и получают модельный образец крови. Затем к раствору гемоглобина добавляют додецилсульфат натрия и тимеросал и получают реагент-калибратор с pH 7-8.

В таблице 1 представлены данные зависимости стабильности рабочего раствора реагента от используемого количества азида натрия.

В табл. 2 представлены данные по влиянию концентраций тимеросала на стабильность калибратора.

Из таблиц 1 и 2 видно, что использование азида натрия и тимеросала в оптимальных концентрациях позволяет повысить стабильность реагента-комплексообразователя и калибратора.

Определение концентрации гемоглобина в крови осуществляют следующим образом: к пробе крови (20 мкл) добавляют 5 мл реагента-комплексообразователя и через 5 минут измеряют оптическую плотность раствора на длине волны 540 нм. Содержание гемоглобина в крови (C) в г/л определяют по формуле:

где A - оптическая плотность исследуемой пробы, ед.опт.пл.;
C_к - концентрация гемоглобина в калибраторе, г/л;
A_к - оптическая плотность калибратора, ед.опт.пл.

Определяющими существенными отличиями предлагаемого набора реагентов для определения концентрации гемоглобина в крови по сравнению с прототипом являются:
- реагент-комплексообразователь дополнительно содержит азид натрия в количестве 0,0003-0,001%, что позволяет повысить стабильность реагента и срок годности его рабочих растворов;
- калибратор дополнительно содержит тимеросал в количестве 0,03-0,08%, что позволяет повысить стабильность последнего при хранении.

Поиск по источникам патентной и научно-технической литературе не выявил сведений о наборе реагентов для определения концентрации гемоглобина в крови, аналогичного заявляемому.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1.

Предварительно готовят реагент-комплексообразователь и калибратор. Для приготовления реагента-комплесообразователя в мерную колбу вместимостью 1 литр вносят 0,6 г додецилсульфата натрия, затем на микроаналитических весах взвешивают 5 мг азида натрия и переносят туда же, приливают 500 мл дистиллированной воды и перемешивают. Объем раствора доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.

Для приготовления калибратора взвешивают 0,6 г додецилсульфата натрия и 0,5 г тимеросала. Навески переносят в мерную колбу вместимостью 1 литр, приливают 3,10 мл эритроцитарной массы, добавляют 500 мл дистиллированной воды и перемешивают, после чего объем раствора доводят до метки дистиллированной водой и вторично перемешивают.

В результате получают набор реагентов для определения гемоглобина в крови, который включает реагент-комплексообразователь, содержащий, мас.%:
Додецилсульфат натрия - 0,06
Азид натрия - 0,0005
Вода - Остальное
и калибратор, содержащий, мас.%:
Гемоглобин - 14,0
Додецилсульфат натрия - 0,06
Тимеросал - 0,05
Вода - Остальное
При этом значение pH реагента-комплексообразователя и калибратора составляет 7,3.

Пример 2.

Приготовление реагента-комплексообразователя и калибратора осуществляют аналогично примеру 1.

Получают набор реагентов для определения гемоглобина в крови, который включает реагент-комплексообразователь, содержащий, мас.%:
Додецилсульфат натрия - 0,15
Азид натрия - 0,001
Вода - Остальное
и калибратор, содержащий, мас.%:
Гемоглобин - 15,0
Додецилсульфат натрия - 0,15
Тимеросал - 0,08
Вода - Остальное
При этом значение pH реагента и калибратора составляет 7,5.

Пример 2.

Приготовление реагента-комплексообразователя и калибратора осуществляют аналогично примеру 1.

Получают набор реагентов для определения гемоглобина в крови, который включает реагент-комплексообразователь, содержащий, мас.%:
Додецилсульфат натрия - 0,15
Азид натрия - 0,001
Вода - Остальное
и калибратор, содержащий, мас.%:
Гемоглобин - 15,0
Додецилсульфат натрия - 0,15
Тимеросал - 0,08
Вода - Остальное
При этом значение pH реагента и калибратора составляет 7,8.

Пример 3.

Приготовление реагента-комплексообразователя и калибратора осуществляют аналогично примеру 1.

Получают набор реагентов для определения гемоглобина в крови, который включает реагент-комплексообразователь, содержащий, мас.%:
Додецилсульфат натрия - 0,03
Азид натрия - 0,0003
Вода - Остальное
калибратор, содержащий, мас.%:
Гемоглобин - 12,0
Додецилсульфат натрия - 0,03
Тимеросал - 0,03
Вода - Остальное
При этом значение pH реагента и калибратора составляет 7,3.

Использование предлагаемого набора реагентов позволит по сравнению с прототипом:
- повысить стабильность набора при хранении путем обеспечения срока годности реагента-комплексообразователя до 2-х лет, а калибратора до 12 месяцев;
- повысить функциональность и универсальность набора за счет обеспечения возможности работы с ним в тех же условиях, что и для набора реагентов для определения концентрации гемоглобина гемиглобинцианидным способом (оптическую плотность растворов измеряют при длине волны 540 нм).

Предлагаемый набор реагентов прошел клинические испытания и рекомендован к серийному выпуску Комитетом по новой медицинской технике Минздрава РФ. Предлагаемый набор реагентов доступен для любой клинико-диагностической и поликлинической лаборатории и позволяет получать точные, достоверные результаты анализа, соответствующие лучшим зарубежным стандартам.

Изобретение относится к медицине и биохимии. Набор реагентов для определения концентрации гемоглобина в крови включает в себя реагент-комплексообразователь и калибратор. При этом реагент-комплексообразователь содержит следующие компоненты, мас.%: додецилсульфат натрия - 0,03-0,15; азид натрия 0,0003-0,001; вода - остальное. Калибратор, входящий в состав набора, содержит следующие компоненты, мас.%: гемоглобин 12,0-15,0; додецилсульфат натрия 0,03-0,15; этиленмеркуртиосалициловой кислоты натриевая соль 0,03-0,08; вода - остальное. Набор реагентов отличается повышенной стабильностью при хранении и простотой использования при допустимой ошибке определения концентрации гемоглобина 1-2%. 2 табл.

Набор реагентов для определения концентрации гемоглобина в крови, включающий реагент-комплексообразователь на основе додецилсульфата натрия и воды при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Додецилсульфат натрия - 0,03 - 0,15
Вода - Остальное
и калибратор, содержащий заданное количество гемоглобина, растворенного в додецилсульфате натрия, и воду, отличающийся тем, что реагент-комплексообразователь дополнительно содержит азид натрия в количестве 0,0003 - 0,001 мас. %, а калибратор дополнительно содержит этиленмеркуртиосалициловой кислоты натриевую соль при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Гемоглобин - 12,0 - 15,0
Додецилсульфат натрия - 0,03 - 0,15
Этиленмеркуртиосалициловой кислоты натриевая соль - 0,03 - 0,08
Вода - Остальное