КОНСОРЦИУМ БАКТЕРИЙ (STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS, STREPTOCOCCUS BOVIS, LACTOBACILLUS SALIVARIUS VAR SALICINICUS, LACTOBACILLUS SALIVARIUS VAR SALIVARIUS, LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS) ДЛЯ АКТИВАЦИИ ПОЧВЕННОЙ МИКРОФЛОРЫ Российский патент 1996 года по МПК A01N63/00 C12P39/00 

Изобретение относится к биотехнологии и сельскохозяйственной микробиологии, в частности к получению бактериальных препаратов, применяемых в растениеводстве, и касается консорциума бактерий для получения вышеуказанных препаратов.

Известно, что средой обитания молочнокислых бактерий является почва, где они сосредоточены вокруг корневой системы растений. Образуя молочную кислоту, они способствуют развитию ряда других микроорганизмов, которые используют ее в качестве питательного компонента. Кроме того, размножаясь в ризосфере, молочнокислые бактерии обладают свойствами фосфоробактерий. Трехкальциевый фосфат они переводят в растворимую форму.

Титр молочнокислых бактерий в почве можно считать косвенным показателем обогащенности ее органическим веществом и окультуренности.

Наиболее часто в почве встречаются следующие виды молочнокислых бактерий: Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris, Streptococcus durans, Streptococcus raecalis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus fermenti, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus leichmanii.

Целью изобретения является получение консорциума молочнокислых бактерий 5842 (Streptococcus thermophilus, Streptococcus bovis, Lactobacillus salivarius var. salicinicus, Lactobacillus salivarius var. salivarius, Lactobacillus acidophillus) продуцента препарата для активации почвенной микрофлоры.

Предлагаемый консорциум не содержит наиболее часто встречающихся видов, которые, как правило, присутствуют в окультуренных почвах, и состоит из перечисленных выше молочнокислых бактерий, являющихся термофилами, продуцентами молочной кислоты и цитокининов. Внесение в почву культур предлагаемого консорциума обогащает видовой состав почвенной микрофлоры и увеличивает титр молочнокислых бактерий ризосферы за счет активных кислотообразователей и продуцентов цитокининов.

Консорциум выделен из образцов почвы, взятых на территории, прилегающей к молокозаводу (Фергана, Узбекистан) с целью получить более широкий спектр видов молочнокислых бактерий, чем обычные составы молочнокислых бактерий ризосферы.

Для выделения консорциума применяли прямой высев из образцов почвы, накопительные культуры на жидких средах со спиртом, последующий высев на агаризованные среды с мелом. Затем производили отбор по термофильности, высокой продуктивности молочной кислоты и цитокининов (био-тест на цитокинины).

При определении таксономического состава консорциума микроскопирование глубинных колоний позволяет определить соотношение: а) молочнокислых палочек и б) стрептококков в исследуемом пассаже консорциума. Колонии палочек (а) по морфологии локонообразные или звездчатые с выростами по периферии и плотным центром. Колонии стрептококков (б) в виде плотных правильных дисков. Для получения глубинных колоний с характерной структурой роста в чашки Петри с двухсуточной культурой консорциума (до 100 колоний на чашке) заливается слой питательной среды, расплавленной и охлажденной до 45^оС и культивируется еще 48 ч.

Доминирующим компонентом консорциума являются стрептококки, количество их составляет 65-75% Варьирование компонентов консорциума может зависеть от состава питательной среды. При увеличении процента углеводов и одновременном уменьшении процента азотистых веществ доминирующим компонентом в консорциуме становятся молочнокислые палочки (до 80-90%).

Культивирование консорциума на постоянной регламентной среде (10%-ное обезжиренное молоко) обеспечивает соотношение стрептококков порядка 65-75% и кисломолочных палочек порядка 25-35% без утраты функциональной целостности консорциума.

Одной из причин неделимости консорциума является защита культур от бактериофагов. Избирательность бактериофагов и малая вероятность попадания в культуру консорциума одновременно разных фагов, специфичных ко всем составляющим консорциум культурам, дают гарантию развития некоторых из них и накопления молочной кислоты до предела, при котором не могут существовать бактериофаги. Кроме того, более энергичное развитие одних культур обеспечивает быстрое накопление молочной кислоты до указанного предела, следовательно, медленно растущие молочнокислые бактерии оказываются под надежной защитой.

Высев моноколониальных изолятов консорциума на обезжиренное молоко и изучение их кислотообразующей активности, способности сбраживать углеводы и других физиолого-биохимических свойств дают возможность определить видовой состав консорциума.

Streptococcus thermophilus растут при 50^оС, не растут при 10, 13 и 16^оС. Сбраживают мальтозу, раффинозу, не сбраживают арабинозу, ксилозу; некоторые штаммы не сбраживают маннит и сорбит; предпочтительное использование сахарозы и лактозы перед глюкозой.

Streptococcus bovis слабый и медленный рост при 50^оС, при 10, 13 и 16^оС не растут. Сбраживают мальтозу, раффинозу, инулин; не всегда маннит и сорбит; глюкозу сбраживают интенсивнее, чем лактозу и сахарозу.

Lactobacillus salivarius var. salicinicus растут при 50^оС, не растут при 20^оС и никогда не растут при 15^оС. Сбраживают галактозу, лактозу, мальтозу, маннит, мелибиозу, салицин, сорбит, сахарозу, раффинозу, трегалозу. Не сбраживают рамнозу.

Lactobacillus salivarius var. salivarius растут при 50^оС, не растут при 20^оС и никогда не растут при 15^оС. Сбраживают рамнозу, галактозу, лактозу, мальтозу, маннит, мелибиозу, сорбит, сахарозу, рафулинозу, трегалозу. Не сбраживают салицин.

Lactobacillus acidophilus растут при 50^оС, обычно не растут при 20^оС и никогда не растут при 15^оС. Сбраживают целлобиозу, галактозу, лактозу, мальтозу, мелибиозу, салицин, сахарозу, трегалозу. Не сбраживают рамнозу, маннит, сорбит, слабо сбраживают раффинозу.

Подобный консорциум не описан в литературе и выделен впервые.

Консорциум принят на депонирование в Центральный музей промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика под номером В-5972.

Физиологической особенностью консорциума, в целом имеющей практическое значение, является продуцирование биологически активных веществ. Все культуры, входящие в консорциум, термофилы, температурные границы хорошего роста и высокой активности 30-45^оС, оптимум 38-40^оС. Брожение гомоферментативное. По морфологии бактерии консорциума представляют собой палочки и кокки. Палочки часто образуют цепочки, особенно в поздней логарифмической фазе роста. Неподвижны, неспорообразующие, грамположительные, становятся грамотрицательными с возрастом и при повышенной кислотности. Кокки клетки сферические или овальные, одиночные, в парах или цепочках. Неподвижные, неспорообразующие, грамположительные.

Культуру консорциума выращивают на питательной среде следующего состава,
Сухое обезжиренное молоко 10,0
Вода До 100,0
Исходное значение рН среды естественное. Культуру выращивают в течение 8-14 ч до рН 3,8-4,0.

Жидкую культуру с титром живых клеток от 1,0 до 8,0 млрд/мл, содержанием молочной кислоты от 10 до 14 г/л и активностью по био-тесту на цитокинины (на проростках редиса( от 130 до 150% используют для приготовления препарата, применяемого в растениеводстве для активации почвенной микрофлоры.

Культуры консорциума сохраняются в лиофилизированном виде в ампулах.

Перед высушиванием в культуру в качестве защитной среды добавляют сахарозо-желатиновую смесь (4% желатины, 40% сахарозы, вода) в количестве 75% к объему жидкой культуры и разливают по 2 мл в ампулу.

Срок хранения сухой культуры до 2 лет при температуре (-4)-(+4)^оС.

П р и м е р 1. При производственном культивировании для получения посевной культуры 1 ампулу сухого материала консорциума засевали в 100 мл обезжиренного 10%-ного молока (1 пассаж).

Выращенной посевной культурой 1 пассажа в количестве 10% от объема питательной среды засевали колбы для получения посевной культуры 2 пассажа. Культивирование посевной культуры консорциума молочнокислых бактерий 1 и 2 пассажей вели при температуре 40^оС в течение 10 ч:
рН выращенного посевного материала 1 и 2 пассажей 3,9.

Посевной материал 2 пассажа использовали для приготовления инокулята (10% к объему питательной среды). Культивирование в инокуляторе вели при температуре 40^оС в течение 10 ч. Значение рН в конце процесса ферментации 3,8.

Культивирование в ферментере вели при температуре 40^оС в течение 8 ч. Значение рН жидкой культуры в конце ферментации 3,8. В качестве питательной среды использовали 10%-ное обезжиренное молоко.

Полученную жидкую культуру с титром 1,0 млрд/мл, содержанием молочной кислоты 11 г/л и активностью по био-тесту на цитокинины (на проростках редиса) 130% использовали для приготовления препарата.

П р и м е р 2. Для приготовления 5,0 л препарата компоненты смешивали в соотношении: сухие водоросли (Fucus) 30,0 г; мочевина 35,0; культура консорциума 5842, полученная в примере 1, 1000,0 мл; пропинол 600,0 мл; натрий бензоат 12,5 г; кальций пропионат 12,5 г; аскорбиновая кислота 15,0 г; комплексонаты (смесь) 3,5 г; вода до 5,0 л.

Для приготовления препарата использовали смесь следующих комплексонатов в равных весовых соотношениях: Na₂СоЭДДЯК, HFеЭДДЯК, Na₂MnЭДДЯК, Na₂MgЭДДЯК, Na₂ZnЭДДЯК, Мо-ОЭДФ.

Сухие водоросли предварительно замачивают в небольшом количестве воды.

После внесения мочевины кислотность смеси доводили до значения рН 5,0.

рН готового препарата 4,7.

Активность по биотесту на цитокинины (на проростках редиса) 138,0%
Полученным препаратом в полевых условиях обрабатывали почву под хлопок (серозем, средний суглинок рН 5,5) и под капусту в момент высадки рассады в открытый грунт (дерново-подзолистая, средний суглинок рН 6,1) из расчета 1 л на гектар.

Численность микроорганизмов при обработке почвы АПМ (в млн, на 1 г сухой почвы) приведена в таблице.

Применение АПМ повысило урожай хлопка на 12,8% и капусты на 16,0% (по сравнению с контролем).

Использование: сельскохозяйственная микробиология, получение бактериальных препаратов, используемых в растениеводстве. Сущность изобретения: консорциум бактерий (Streptococcus thermophilus, Streptococcus bovis, Lactobacillus salivarius var salicinicus, Lactobacillus salivarius var salivarius, Lactobacillus acidophilus 5842 выделен из почвы, депонирован в коллекции промышленных микроорганизмов под N В-5972. Консорциум культивируют на обезжиренном молоке при 40^oС в течение 8 ч. Получают культуральную жидкость с титром клеток 1,0 млрд/мл, с содержанием молочной кислоты 11,0 г/л, и активностью по био-тесту на цитокинины (на проростках редиса) 130%. Культуральную жидкость смешивают с наполнителями и микроэлементами и обрабатывают почву. 1 табл.

Консорциум бактерий (Streptococcus thermophilus, Streptococcus bovis, Lactobacillus salivarius var salicinicus, Lactobacillus salevarius var salivarius, Lactobacillus acidophilus) ВКПМ В-5972 для активации почвенной микрофлоры.