Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, в частности к получению бактериальных препаратов, применяемых в растениеводстве, и касается консорциума бактерий для получения вышеуказанного препарата.
Известно, что молочнокислые бактерии содержатся в эпифитной микрофлоре культурных растений.
Наиболее часто встречающиеся виды: Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris, Streptococcus faecalis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus fermenti, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei.
Ряд видов этих бактерий (Streptococcus faecalis, Streptococcus lactis, Lactobacillus plantarum) можно отнести к типичным представителям эпифитной микрофлоры.
Установлено, что максимальное количество молочнокислых бактерий содержится на растениях вблизи населенных пунктов, с удалением от жилья титр молочнокислых бактерий на растениях падает.
Целью изобретения является получение консорциума молочнокислых бактерий 3843 Lactobacillus lactis, Lactobacillus salivarius var.salivarius, Lactobacillus acidophilus, состоящего из культур, образующих в больших количествах молочную кислоту и цитокинины, и являющегося продуцентом препарата для активации фотосинтеза.
Предлагаемый консорциум не содержит наиболее часто встречающихся видов молочнокислых бактерий эпифитной микрофлоры, выделен с территории молокозавода (Фергана, Узбекистан) и состоит из культур, активно образующих молочную кислоту и цитокинины.
Применение культур предлагаемого консорциума в период интенсивного роста растений и стадии, близкой к цветению, обогащает видовой состав эпифитной микрофлоры, увеличивает титр молочнокислых бактерий за счет активных кислотообразователей и продуцентов цитокининов и повышает естественный иммунитет растений.
Для выделения консорциума применяли прямой высев с растений на элективные агаризованные питательные среды в чашки Петри, накопительные культуры на жидких средах со спиртом, последующий высев на агаризованные среды с мелом. Затем производили отбор по термофильности, высокой продуктивности молочной кислоты и цитокининов (био-тест на цитокинины).
Морфологию колоний культур консорциума определяли микроскопированием глубинных колоний. Для этого в чашки Петри с двухсуточной культурой консорциума (до 100 колоний на чашке) заливали слой питательной среды, расплавленной и охлажденной до 45оС, и культивировали еще 48 ч. Колонии молочнокислых бактерий консорциума по морфологии локонообразные и звездчатые с выростами по периферии и плотным центром.
Одной из причин неделимости консорциума является защита культур от бактериофагов. Избирательность бактериофагов и малая вероятность попадания в культуpу консорциума одновременно разных фагов, специфичных ко всем составляющим консорциум культурам, дает гарантию развития некоторых из них и накопления молочной кислоты до предела, при котором не могут существовать бактериофаги. Кроме того, более энергичное развитие одних культур обеспечивает быстрое накопление молочной кислоты до указанного предела, таким образом, медленно растущие молочнокислые бактерии оказываются под надежной защитой.
Высев моноколониальных изолятов консорциума на 10%-ное обезжиренное молоко и изучение из кислотообразующей активности, способности сбраживать углеводы и других физиолого-биохимических свойств дают возможность определить видовой состав консорциума.
Lactobacillus lactis растут при 45оС и выше, обычно не растут при 20оС и никогда не растут при 15оС. Сбраживают фруктозу, галактозу, глюкозу, лактозу, мальтозу, маннозу, салицин, сахарозу, трегалозу, эскулин. Не сбраживают ксилозу, сорбит, рамнозу, раффинозу, мелибиозу, мелецитозу, целлобиозу, арабинозу, декстрин.
Lactobacillus salivarius var.salivarius растут при 50оС, не растут обычно при 20оС и никогда не растут при 15оС. Сбраживают рамнозу, галактозу, лактозу, мальтозу, маннит, мелибиозу, сорбит, сахарозу, раффинозу, трегазолу. Не сбраживают салицин.
Lactobacillus acidophilus растут при 50оС, обычно не растут при 20оС и никогда не растут при 15оС. Сбраживают целлобиозу, галактиозу, лактозу, мальтозу, мелибиозу, салицин, сахарозу, трегалозу. Не сбраживают рамнозу, маннит, сорбит; слабо сбраживают раффинозу.
Подобный консорциум не описан в литературе и выделен впервые.
Консорциум принят на депонирование в Центральный музей промышленных микроорганизмов ВНИИгенетика под номером В-5973.
Физиологической особенностью консорциума в целом, имеющей практическое значение, является продуцирование биологически активных веществ. Все культуры, составляющие консорциум,термофилы, температурные границы хорошего роста и высокой активности 30-45оС, оптимум 38-40оС. Брожение гомоферментативное.
По морфологии бактерии консорциума представляют собой палочки от длинных и тонких до коротких типа коккобацилл. Часто образуют цепочки, особенно в поздней логарифмической фазе роста. Неподвижны, неспорообразующие, грамположительные, становятся грамотрицательными с возрастанием и при повышенной кислотности.
Культуру консорциума выращивают на питательной среде следующего состава,
Сухое обезжиренное молоко 10,0 Вода До 100,0
Исходное значение рН питательной среды естественное.
Культуру выращивают в течение 8-14 ч до рН 3,8-4,0.
Жидкую культуру с титром живых клеток от 1,0 млрд/мл до 5,0 млрд/мл, содержанием молочной кислоты от 12 до 14 г/л и активностью по бис-тесту на цитокинины (на проростках редиса) от 120 до 150% используют для приготовления препарата, применяемого в растениеводстве для активации фотосинтеза.
Культура консорциума сохраняется в лиофилизированном виде в ампулах.
Перед высушиванием в культуру консорциума в качестве защитной среды добавляют сахарозо-желатиновую смесь (4% желатины, 40% сахарозы, вода) в количестве 75% к объему жидкой культуры и разливают в ампулы по 2 мл.
Срок хранения сухой культуры до 2 лет при температуре (-4)-(+4)оС.
П р и м е р 1. При производственном культивировании для получения посевной культуры 1 ампулу сухого материала консорциума засевали в 100 мл обезжиренного 10%-ного молока (1 пассаж).
Выращенной посевной культурой 1 пассажа в количестве 10% засевали колбы с 400 мл питательной среды для получения посевной культуры 2 пассажа.
Выращивание посевной культуры консорциума молочнокислых бактерий 1 и 2 пассажей вели при температуре 40оС в течение 14 ч, рН в конце роста 3,8.
Посевной материал 2 пассажа использовали для приготовления инокулята (10% к объему питательной среды). Культивирование в инокуляторе вели при температуре 40оС в течение 10 ч до рН 3,8.
Посевной культурой из инокулятора засевали ферментер из расчета 10% от объема питательной среды.
Культивирование в ферментере вели при 40оС в течение 8 ч. В качестве питательной среды использовали 10%-ное обезжиренное молоко. Значение рН жидкой культуры в конце ферментации 3,8.
Полученную жидкую культуру с титром 5,0 млрд/мл, содержанием молочной кислоты 14 г/л и активностью по био-тесту на цитокинины (на проростках редиса) 140% использовали для приготовления препарата.
П р и м е р 2. Для приготовления 10,0 л препарата компоненты смешивали в следующем соотношении: сухие водоросли (Fucus) 100,0 г; мочевина 120,0 г; культура консорциума 3843, полученная в примере 1, 3,5 л; натрий бензоат 20,0 г; кальций пропионат 20,0; аскорбиновая кислота 11,0 г; комплексонаты (смесь) 11,0 г; калий фосфорнокислый однозамещенный 8,0 г; вода до 10,0 л.
Для приготовления препарата использовали смесь следующих комплексонатов в равных весовых соотношениях: Мо-ОЭДФ, К2ZnОЭДФ, К2СоОЭДФ, НFeЭДДЯК, Na2MgЭДДЯК, Na2MnЭДДЯК, Na2CuЭДДЯК.
Сухие водоросли предварительно замачивали в небольшом количестве воды.
После внесения мочевины кислотность смеси доводили до значения рН 4,9.
рН готового препарата 4,7.
Активность по био-тесту на цитокинины (на проростках редиса) 150,0%
Полученным препаратом двукратно обрабатывали ячмень и капусту из расчета 1,0 л на гектар. Применение АФ на ячмене увеличило интенсивность фотосинтеза в 1,9 раза и повысило урожай на 17,3% (по сравнению с контролем). Применение препарата на капусте увеличило интенсивность фотосинтеза в 2,1 раза и привело к повышению урожая на 36,8% по сравнению с контролем.
Использование: сельскохозяйственная микробиология, получение бактериальных препаратов, применяемых в растениеводстве. Сущность изобретения: консорциум бактерий (Lactobacillus salivarius var salivarius, lactobacillus acidophilus, lactobacillus lactis) выделен с растений, депонирован в коллекции промышленных микроорганизмов под номером В - 5973. Консорциум культивируют на обезжиренном молоке при исходном pH 3,8, температуре 40 С в течение 8 ч. Получают жидкую культуру бактерий с титром 5,0 млрд/мл, содержащую 14 г/л молочной кислоты, активность культуры на цитокинины 140%. В полученную культуральную жидкость вносят наполнители и микроэлементы и используют для обработки растений.
Консорциум бактерий (Lactobacillus salivarius var salivarius, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus lactis) В-5973 для активации фотосинтеза.
| Филимонова М.В | |||
| Физиологически активные вещества фитопатогенных грибов рода Botrytis, Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук | |||
| Вильнюс, 1987, с.5-10. |
