СПОСОБ УКОРЕНЕНИЯ ПЫЛЬЦЕВЫХ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ ПЛОДОВЫХ ПОРОД Российский патент 1996 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению и выращиванию растений-регенератов, возникающих из длительно культивируемых in vitro пыльцевых каллусных тканей плодовых растений, и может найти применение в селекции при получении гаплоидных и гомозиготных форм, а также в растениеводстве при размножении оздоровленного посадочного материала.

При получении и выращивании растений-регенерантов из длительно культивируемых in vitro каллусных тканей, в том числе и пыльцевого происхождения, наиболее критическим периодом считается их перенос в почвенные условия. Плохая адаптация пробирочных растений к почвенным условиям во многом объясняется недостаточным развитием и функционированием их корневой системы, ее повышенной уязвимостью. Для нормального развития растений в грунте требуется образование новых корней с достаточным количеством корневых волосков. Ряд авторов [1,2] предлагают при переносе растений-регенерантов из условий искусственной культуры в обычную почву использовать для активизации роста корней один из следующих приемов: доращивание корней в жидкой питательной среде перед посадкой в грунт, обработка их раствором ауксина, пересадка растений в такой фазе, когда у них имеются зачатки корней (дальнейший рост корней происходит уже в грунте). Однако эти приемы оказались неэффективными для улучшения приживаемости пыльцевых растений-регенерантов в почве.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является способ, разработанный Высоцким и др. [3] при котором растения-регенеранты переносят на почвенный субстрат, помещая в него корневую систему вместе с агаризованной питательной средой.

Способ-прототип имеет недостатки. Он мало эффективен для растений, регенерировавших из длительно культивируемых каллусных тканей, а пыльцевые-регенеранты плодовых культур, как правило, могут быть получены лишь после нескольких пересевов каллусов на новые питательные среды. Считается, что во время этих пересевов теряются определенные эндогенные вещества, имеющие важное значение для адаптации растений-регенерантов к почвенным условиям. К тому же пыльцевые каллусы и растения, полученные из них, отличаются цитологической нестабильностью, что также снижает их адаптационные возможности. Вследствие всех указанных причин, при использовании способа-прототипа корни пыльцевых растений-регенерантов после пересадки в грунт вместе с агаризованной питательной средой слабо образуют корневые волоски. Наблюдается также быстрое инфицирование почвенными патогенами питательной среды около корней, а затем и самих корней, что, в конечном счете, приводит растения к гибели.

Целью предлагаемого способа является повышение приживаемости в почвенных условиях растений-регенерантов, полученных из длительно культивируемых каллусных тканей пыльцевого происхождения, за счет раннего, уже в условиях in vitro, укоренения их в почве.

Предлагаемый способ отличается от прототипа тем, что подготовленные для укоренения побеги-регенеранты, еще не имеющие корней, пересаживают в сосуды, в нижней части которых находится увлажненный почвенный субстрат, а над ним слой агаризованной питательной среды, для укоренения. Процесс корнеобразования начинается в агаровой питательной среде, а затем образовавшиеся корни растут в почвенном субстрате. По мере усыхания и уменьшения объема агаризованной питательной среды ее место заполняют почвенным субстратом. Таким образом, в одном сосуде происходит образование корней и их рост в почве. Через 2 месяца выращивания в таких условиях растения с нормально сформированной корневой системой переносят в открытый грунт. Предложенный способ позволяет достичь 83-100% приживаемости в открытом грунте пыльцевых растений-регенерантов.

На чертеже изображен культивационный сосуд 1, в нижней части которого находится почвенная смесь 2, а над ней агаризованная питательная среда 3, в которую посажен побег 4, образовавший корни 5.

Способ осуществляют следующим образом.

В нижнюю часть культивационных сосудов 1 (примерно на 1/3 их высоты) насыпают почвенный субстрат 2, который готовят из торфа, песка и перегноя в соотношении 1: 1: 1 и увлажняют раствором солей по прописи Мурасиге-Скуга в половинной концентрации. В отдельных сосудах готовят агаровую питательную среду для корнеобразования. Она содержит агар, сахарозу, витамины, макро- и микросоли по Мурасиге-Скуга, а также в качестве индуктора корнеобразования индолил-масляную кислоту (ИМК) в концентрации 1-2 мг/л. Сосуд с почвенным субстратом и с агаровой средой закрывают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют в автоклаве. После стерилизации горячую, незастывшую агаровую среду разливают в стерильных условиях в сосуды с почвенным субстратом. При этом агаровая питательная среда 3 располагается над почвенным субстратом, не смешиваясь с ним, и высота ее составляет примерно 1/6 часть от высоты почвенного слоя. После застывания агаровой среды проводят посадку побегов-регенерантов в стерильных условиях. Для этого побеги срезают с каллусов и высаживают на слой агаровой питательной среды так, чтобы концы побегов 4 располагались только в этом слое, не доходят до почвы. После посадки побегов пробирки помещают в условия 16-часового фотопериода при освещенности 1000-1500 люкс и температуре воздуха 20-24^оС. Через 2-3 недели в агаровой среде на концах побегов начинается образование корней, которые в течение 2-4 последующих недель достигают почвенного слоя и затем растут в нем [5] По мере подсыхания слоя агаровой питательной среды на ее место подсыпают увлажненный почвенный субстрат и к концу выращивания происходит практически полная замена агаровой питательной среды почвой. К концу второго месяца культивирования у растений образуется хорошо развитая, полностью адаптированная к почве корневая система и растения пересаживают в открытый грунт или теплицу.

В таблице приводятся данные по приживаемости в открытом грунте растений-регенерантов, полученных из пыльцевых каллусов вишни и яблони. Они показывают, что приживаемость растений по заявленному способу в 2-3 раза выше, чем у прототипа и составляет 83,3-100

Использование: в биотехнологии, в селекции при получении гаплоидных и гомозиготных форм и в растениеводстве при размножении оздоровленного посадочного материала. Сущность изобретения: подготовленные для посадки побеги-регенеранты, еще не имеющие корней, сажают в сосуды, в нижней части которых находится увлажненный субстрат, а над ним - слой агаризованной питательной среды для корнеобразования. Процесс корнеобразования начинается в агаровой питательно среде, а затем корни растут в почвенном субстрате. После образования хорошо развитой системы растения переносят в открытый грунт. Приживаемость составляет 83 - 100%. 3 з. п. ф-лы, 1 ил, 1 табл.

1. СПОСОБ УКОРЕНЕНИЯ ПЫЛЬЦЕВЫХ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ ПЛОДОВЫХ ПОРОД, включающий срезание побегов с пыльцевых каллусов, посадку их на специально подготовленный субстрат в стерильных условиях, отличающийся тем, что срезанные побеги сажают в сосуды на агаровую питательную среду, налитую поверх почвенной смеси, содержащей в равных долях торф, песок и перегной. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что объем почвенной смеси составляет 1/3 объема сосуда. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что почвенную смесь увлажняют разбавленным вдвое раствором Мурасиге - Скуга. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что высота питательного агарового слоя составляет 1/6 высоты почвенного слоя.