Способ выращивания растений томатов @ @ Советский патент 1984 года по МПК A01H3/00 

о

оо

4

} зобретение относится к сельском хозяйству и может быть использовано g селекции и семеноводстве растений в частности селекции томатов, в исследованиях по генетике: фитопатологии и физиологии растений.

Известен способ размножения на искусственной питательной среде клевера, согласно которому в качестве исходного материала используют листочки растений с надрезами,по всей плоскости листовой пластинки, которые 2-3 недели инкубируют на агариЗованной питательной среде Гамборга Bj с добавлением нитрата аммония, 2,4-«дихлорфеноксиуксусной кислоты (8-16 мг/л), кинетина (.6-10 мг/л) и нафтилуксусной кислоты (0,1-0,5 мг/л) .при непрерывном освещении люминесцентными лампами с последующей пересадкой на ту же питательную среду, но без нитрата аммония, в которой вышеназванных тр гормона заменены одним бензиламинопурином (0,2-0,8 мг/л). На этой среде они культивируются в те же условиях в течение двух-четырех недель до появления зеленых стебле.вых почек и проростков., которые Лереносят на агаризованную среду Гамборга Е, разбавленную вдвое без гормонов си.

Известен способ размножения на искусственных питательных средах растений культурных и диких видов томатов, согласно которому отрезки семядолей, листьев и стеблей стерильных проростков томатов для получения первичного каллуса высаживают на среду Мурасиге и Скуга с высоким содержанием гормонов (ауксина ИУК 16 мг/л , кинетина 4 мг/л, аденина 40 мг/л) и инкубируют при 24-26 0 под лампами дневного света 3-4 над. Затем для меристематизации образовавшегося каллу его переносят в условий повышенног освещения (5-10 тыс.люкс и выше) н среду для регенерации (6-8 мг/л кинетина и 5-6 мг/л ИУК) либо осталяют на исходной среде. При этом стеблевые почки и проростки образуются у 15-25% полученных каллусов. Затем проростки пересаживают на среду для корнеобразования без гормонов и с пониженным содержанием агар-агара. Регенеранты с корнями высаживают сначала в вермикулит с питательным раствором Кнопа, а затем (через 5-7 дней) в обычный грунт.

Получение регенерантов по данному способу требует в лучшем случае около 70 дней (всего из тысячи с лишним каллусов получено 50 растений сорта Бизон 12 растений вида L.peruvianum и Одно растение вида L.hirsutum) С23

Недостатками этого способа являются низкие продуктивность и надежность и оольшие временные затраты.

Цель изобретения - ускорение процесса выращивания.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выращивания растений томатов in vitro эксплантаты культивируют непосредственно на среде для регенерации при этом культивирование проводят первые 710 сут в темноте. .Причем в качестве эксплантата используют листья проростков.

Кроме того, среда для регенерации представляет собой модифицированную среду Мурасиге и Скуга, которая содержит -канетина 4 мг/л, а индолилуксусной кислоты 0,4 мг/л.

Способ осуществляют следующим образом.

Материал инкубируют 7-10 сут в полной темноте при 25-27 С и относительной влажности воздуха 95-100% в закрытых прозрачных сосудах. К концу этого периода на утопленной в среде части черешка образуется тканевой наплый с этиолированными стеклевыми почками и отдельными проростками до 2/3 мм длиной. Затем сосуды с указанными эксплантатами переводят в условия 16-часового фотопериода при освещенности 30005000 лк и той же температуре, после чего этиолированные стеблевые почки ,и проростки зеленеют и начинают быстро расти и развиваться. Обычно у основания черешка наиболее активно развивается 1-3 регенеранта, которые начинают доминировать, подавляя развитие менее развитых регенерантов и неразвившихся стеблевых почек, достигая через две-три/недели 1-2 см

Размножившееся у основания черешк регенеранты и стеблевые почки расчленяют и рассаживают на агаризованную, разбавленную вдвое среду Мурасиге и Скуга без гормонов для доращивания и укоренения. При тех же температурных условиях и фотопериоде выращивание на данной среде продолжают еще одну-две недели до появления у регенерантов 2-,3 листьев и корКей, после чего их пересаживают в почвенно-торфяную смесь с рН 5-6,5 и выращивают в обычных условиях.

В случае необ содимости одновременого получения большего количества одновозрастных регенерантов ткань со сформировавшимися стеблевыми почкс1Ми и проростками отделяют от листа-питателя, дробят на несколько кусочков, пересаживают на исходную среду для регенерации.и культивирую в указанных выше условиях фотопернода. При этом в течение 10-15 дн объем этих кусочков и количество

стеблевых почек и проростков можно повторить несколько раз, после чего эксплантаты расчленяют на отдельные регенеранты и стеблевые почки и высаживают на среду для доращйвания и укоренения. В этом случае добавляется определенное количество циклов, что снижает скорость получения взрослых регенерантов. Однако благодаря размножению меристематических очагов при дроблении и последующем культивировании эксплантатов на среде для регенера.ции неограниченно возрастает количество получаемых регенерантов.

Пример 1. Листочки стерильных проростков гибрида М 394хм 504

высаживают на вышеупомянутую среду , для регенерации, фиксируя их вертикально, погружения среза черешка в среду на 1,5-2 IVIM. Высаг женный материал делят на две части.

Первую часть (вариант) инкубируют в условиях 16-часового фотопериода, вторую (вариант П) - первые 10 сут инкубируют в полной темноте, а затем также переносят в условия

того же фотопериода. Интенсивность регенерации оценивают по 5-балльной шкале.

Результаты, полученные в обоих вариантах опытов представлены в таб. 1 .

Таблица

1. СПОСОБ ВЫРАЙЩВАНИЯ РАСТЕНИЙ ТОМАТОВ IN VITRO, включающий получение эксплантатов, выращивание из них первичного каллуса, культивирование его в среде для регенерации ,в условиях, способствующих образованию стеблевых почек и проростков, доращивание полученных стеблевых почек на среде с уменьшенным вдвое содержанием макросолей без гормонов и последующую высадку в грунт, отличающийся тем, что, с целью ускорения процесса выращивания и увеличения выхода растений, эксплантаты культивируют непосредственно на среде для регенерации, при этом культивирование проводят первые 7-10 сут в темноте. 2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве эксплантата испольэуют листья проростков. 3.Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и и с я тем, что среда для регеi нерации представляет собой модифицированную среду Мурасиге и Скуга, (Л которая содержит кинетина 4 мг/л, а индолилуксусной кислоты 0,4 мг/л. С

С первичным действием темноты

В условиях фотопериода

Таким образом, первоначальный темновой период инкубации способствует повышению интенсивности и сокращению сроков регенерации.

Пример 2. На вышеуказанную среду для регенерации высаживают листочки стерильных проростков томатов гибрида Мо393хМо504, которые фиксируют вертикально путем погружения среза черешка в среду на 1,5100

100

Из данных табл. 2 следует, что использс5вание структурно целостного листочка по сравнению с высечкой листа также приводит к повышению, интенсивности и сокращению сроков регенерации.

Пример 3. На среду регенерации высаживают листочки стерильных

5,0

1-2

X

3-4

1,4

2 мм и высечки аналогичных листочков диаметром 0,8 мм помещая на поверхность среды. Ьба варианта культивируют 10 сут в темноте, а затем переносят в условия 16-часового фотопериода. Интенсивность регенерации также оценивают в 5-балльной шкале.

Результаты опыта представлены в табл. 2.

Таблица 2

1-2

5,0 2-4 2,8

проростков гибрида Мо393хМо504 и помещают на 10 сут в условия абсолютной темноты. По истечении темнового периода инкубации материал опыта делили на три части (варианта). Первый вариант переносят в условия фотопериода, второй и третий оставляют еще на 10 сут в темноте, причем

у третьего на среде оставляют лишь ткань с этиолированными стеблевыми почками и проростками, образующуюся на срезе черешка, а сам листочек удаляют. По истечении указанного времени второй и третий варианты также переносят в условия 16-часового фотопериода. Две недели спустя по пятибалльной шкале оценивают регнерационную способность эксплантато трех.вариантов. Регенерационная способность эксплантатов первого варианта .5, второго 3,2 и третьего 1,6 балла.. Таким образом-, Оптимальное время первичной иикубации в темноте равно приблизительно 10 сут, поскольку увеличение этого времени приводит к существенному понижению регенерационной способности эксплантатов. Удаление листочка от образовавшейся на срезе черешка ткани с этиолированными стеблевыми почками

. и проростками приводит к еще боль-, шему понижению регенерационной способности эксплантата.

Пример 4. На среду для регенерации высаживают листочки стерильных проростков томатов Мо393хМо504, инкубируют 10 сут в темноте, затем переносят в условия фотопериода. Спустя две недели опыт делили на две части (варианты| В первом варианте образовавшиеся D тканевом наплыве на срезе черешка доминирующие регенеранты (1-3 шт) и стеблевые почки (7-10 шт отделяют,

и высаживают на разбавленную вдвое агаризованную среду Мурасиге и Скуга без гормонов и продолжают инкубировать в тех же условиях. Во втором варианте от основания черешка отделяют и высаживают на разбавленную среду Мурасиге и Скуга только доминирующие регенеранты, а тканевый наплыв с оставшимися

недоразвитыми проростками, стеблевыми почками и листочком-питателем оставляют на исходной среде и продолжают его культивирование в условиях фотопериода . Спустя 2-3 недели от каждого подвергавшегося дроблению эксплантата получено в среднем 10 развившихся регенерантов, а на эксплантатах же второго варианта развились доминирующие регенеранты (1-3 шт. в среднем на эксплантат). Затем операцию отделения регенерантов повторяют, после чего эксплантаты продолжают культивироваться в тех жеусловиях до образования новых регенерантов и т.д.

Таким образом, в первом варианте опыта за 30-40 дней от каждого эксплантата получено в среднем 10 регенерантов, во втором варианте за 45-75 дн-4 регенеранта.

Предлагаемый способ испытан помимо указанных опытов на томатах сортов Новинка Приднестровья и Ранний-83, мутантах Мо393 и Мо50Ю, диких видах L.hirsutum и Solanum pennellii , а также их гибридах с сортом Новинка Приднестровья и мутантом МоБОО, взятыми в качестве материальной формы. Регенерационная способность Q культурных сортов и мутантов в 1,52 раза ниже, чем дикарей и гибридов, из каждого эксплантата которых получено в среднем 10 регенерантов.

Применяя два типа питательных сред, темновой первоначальный период и систему лист-питатель-ткань с регенерантами в течение 30-40 дней от каждого эксплантата получили 5-10 сформировавшихся растений-регенерантов, которые будучи высаженными в почвенно-торфяную смесь развивались здоровыми и морфологически не отличались от исходных.