ШТАММ STRENPTOMYCES AVERMITILIS - ПРОДУЦЕНТ АВЕРМЕКТИНОВ Российский патент 1995 года по МПК C12P1/06 C12P1/06 C12R1/465 

Изобретение относится к получению биологически активных веществ микробиологическим путем, а именно к производству антипаразитарных препаратов на основе авермектинов.

Известен штамм-продуцент авермектинов Streptomyces avermifilis-50 (лабораторное обозначение Streptomyces avermifilis-198) с продуктивностью 250 ед. Известный штамм был получен путем направленной селекции с помощью специально разработанного нематоцидного теста и предназначен для получения препаратов нематоцидного спектра действия.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является штамм Streptomyces avermifilis АТСС 31272 продуцент восьми индивидуальных авермектинов, композиция которых получила обозначение С-076. Указанная композиция авермектинов обладает широким спектром антипаразитарного действия нематоцидным, акарицидным и инсектицидным. Продуктивность известного штамма составляет в среднем 500 мкг/мл авермектинов.

Цель изобретения создание штамма, продуцирующего повышенные количества авермектинов.

Это достигается тем, что используется новый штамм продуцент авермектинов Streptomyces avermifilis-51 (лабораторное обозначение Streptomyces avermifilis-58), который был получен из популяции штамма Streptomyces avermifilis-50 после обработки суспензии его спор тормозным короткоимпульсным облучением с последующим торможением репаративных процессов и ступенчатым отбором активных вариантов по признаку общее содержание авермектинов с помощью специально разработанного химического теста (схема получения штамма представлена на чертеже 1).

На чертеже приведена схема отбора активных вариантов продуцентов авермектинов (отечественная линия) (единицы нематоцидные единицы).

Предлагаемый штамм депонирован в коллекции микроорганизмов ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии (г. Санкт-Петербург) под номером Streptomyces avermifilis-51.

Предлагаемый штамм характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологическими признаками.

Микроморфологические признаки штамма. Спороносцы образуются в виде правильных спиралей (более восьми витков).

Макроморфологические и культуральные признаки. На 2%-ном глюкозокартофельном агаре на 14-21 день роста при 28^оС, рН 6,8-7,2 образуются колонии диаметром 10-12 мм со светло-серым воздушным мицелием и темно-каштановой обратной стороной колонии. В популяции всегда имеется 2-3% светло-серых колоний с бежевой обратной стороной. Край колонии неровный с белым ободком. Поверхность колонии складчатая, до 8-9 складок. В центре колонии имеется возвышение в виде горошинки, иногда с кратером. К 10 дню роста на поверхности колонии образуются белые бархатистые включения. В зависимости от сорта картофеля в среду может выделяться бурый (темно-каштановый) пигмент.

О цвете воздушного и субстратного мицелия, интенсивности спороношения, а также о наличии или отсутствии растворимых пигментов на разных органических и синтетических агаровых средах можно судить на основании данных табл.1.

Сведения о физиолого-биохимических признаках суммированы в табл.2.

Максимальное накопление авермектинов наблюдается на 5-7 cут. при 28^оС и скорости растворения кислорода 1,0-1,2 ммоль О₂/л/мин.

Антагонистические свойства. Мицелиальные экстракты вызывают гибель нематод, относящихся к родам Haemonchus, Trichostroglus, Оstertagia, Nematodinus, Cooperia, Ascaris, Bunostomum, Оеsophagostonum, Chabertia, Trichuris, Strongylus, Trichonema, Dictigocanlus, Capillaria, Hetеrakis, Тохосara, Ascarida, Оxyuris, Ancуlostoma, Uncinaria, Тoxascaris, Parascaris.

Также их действие губительно для клещей, афидов, вшей, блох, мух, тараканов, двукрылых и прямокрылых вредителей, платяной моли, ковровых и обойных жучков.

Предлагаемый штамм поясняется следующим примером.

П р и м е р. Споры штамма Streptomyces avermifilis-51 выращивают на овсяном агаре в течение 10 сут. при 28^оС. Кусочек агаровой среды (приблизительно 1/8 часть) со спорами вносили в качалочные колбы емкостью 750 мл, содержание 50 мл посевной среды следующего состава, глюкоза 4,0; кукурузный экстракт 0,3 (по техническому весу); соевая мука 1,2; белково-витаминный концентрат (БВК) 0,6; кальций углекислый 0,6; вода водопроводная до 100% Глюкозу стерилизуют отдельно при 0,5 ати 30 мин, и она вносится в колбы в момент засева. Остальные компоненты стерилизуются при 0,8 ати 40 мин. Значение рН до стерилизации 6,5-6,8.

Колбы устанавливают на качалку с числом оборотов 220 в 1 мин и выращивают инокулят при температуре 28^оС в течение 24 ч. Затем инокулят в количестве 5% передают в колбы в ферментационной средой следующего состава, глюкоза 7,0; кукурузный экстракт 0,3 (по техническому весу); соевая мука 1,2; белково-витаминный концентрат (БВК) 0,6; вода водопроводная до 100% Значение рН до стерилизации 6,8-7,2. Стерилизация компонентов раздельная. Глюкоза стерилизуется при 0,5 ати 30 мин, а остальные компоненты при 0,8 ати 40 мин. Глюкоза вносится в колбы в момент засева среды инокулятом.

Ферментацию проводили в течение 168 ч при температуре 28^оС. Авермектины выделяли из мицелия следующим образом. Вначале отделяли мицелий на центрифуге при 3000 оборотах в минуту в течение 10 мин. К влажному осадку, полученному из 10 мл культуральной жидкости, добавляли 10 мл охлажденной водопроводной воды, тщательно перемешивали и центрифугировали при 3000 об/мин 5 мин. Надосадочную жидкость отбрасывали, а к влажному и промытому осадку добавляли 10 мл этанола и проводили экстракцию авермектинов при комнатной температуре при постоянном перемешивании в течение 20 мин. После отделения мицелия при 3000 об/мин в течение 5 мин в центрифугатах определяли общее содержание авермектинов с помощью орцинового реактива (90 мл 0,1% гексагидрата хлорного железа в концентрированной НСl и 10 мл 5% орцина) в н-бутаноле при нагревании в течение 15 ± 5 мин при 80± 5^оС с последующим измерением оптической плотности полученного окрашенного раствора при 630-640 нм. Использовали калибровочный график для определения авермектинов, построенный в осях Д₆₃₀-C мкг/мл, где Д₆₃₀ оптическая плотность при 630 нм; строили по авермектину В_Iа или ивермектину в интервале концентраций 2-20 мкг/мл.

Среднее содержание авермектинов в мицелии Streptomyces avermifilis-51 составляет 700 мкг/мл при размахе изменчивости по данному признаку 500-800 мкг/мл. Известный штамм Streptomyces avermifilis АТСС 31272 продуцирует в среднем 500 мкг/мл.

Таким образом, предлагаемый штамм продуцирует авермектинов Streptomyces avermifilis-51 позволяет получать на 40% авермектинов больше, чем известный штамм Streptomyces avermifilis 31272.

Использование: микробиологическая промышленность, производство антипаразитных препаратов. Сущность изобретения: создание нового штамма, отличающегося способностью к повышенному синтезу авермектинов. Штамм Streptomyces avermitilis 51 получен из популяции штамма Streptomyces avermitilis 50 после обработки тормозным короткоимпульсным облучением с последующим снижением репарационных процессов и ступенчатым отбором активных вариантов. Штамм продуцирует в среднем 700 мкг/мл авермектинов. 1 ил. 2 табл.

Штамм Streptomyces avermitilis ВНИИСХМ-51 продуцент авермектинов.