ШТАММ АКТИНОМИЦЕТА STREPTOMYCES AVERMITILIS - ПРОДУЦЕНТ АВЕРМЕКТИНОВ Российский патент 1996 года по МПК C12P1/06 C12P1/06 C12R1/465 

Изобретение относится к получению биологически-активных веществ путем микробиологического синтеза, а именно к производству антипаразитарных препаратов на основе авермектинов.

Известен штамм продуцент авермектинов Streptomyces avermitilis ATCC 31372, продуцирующий в среднем 500 мкг/мл авермектинов.

Цель изобретения создание штамма, продуцирующего повышенные количества авермектинов с преобладающим содержанием в авермектиновом комплексе авермектинов серии В₁ (В_1а и В_1б) наиболее активных в биологическом отношении.

Цель достигается получением штамма Streptomyces avermitilis ВНИИСХМ-54, продуцирующего в среднем 1500 мкг/мл авермектинов при размахе изменчивости 1200-1800 мкг/мл. Предлагаемый штамм был получен путем направленной селекции из популяции штамма Streptomyces avermitilis-51. Отбор активных вариантов проводили по двум признакам: по способности к авермектинообразованию (оценивалась способность вариантов продуцировать весь авермектиновый комплекс); и по способности к биосинтезу авермектинов серии В₁ (оценивалась способность вариантов продуцировать только авермектин В_1а и авермектин В_1б). Схема получения штамма представлена на чертеже.

На чертеже приведено общее содержание авермектинов (мкг/мл) процентное содержание авермектинов серии В₁ в авермектиновом комплексе (%).

Предлагаемый штамм характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологическими признаками.

Микроморфологические признаки штамма.

Культура имеет спороносцы в виде правильных спиралей.

Макроморфологические и культуральные признаки.

На 2% -ном глюкозокартофельном агаре на 14-21 день роста при 28^оС, рН 6,8-7,2 образуются колонии диаметром 10 мм со светло-серым воздушным мицелием и темно-каштановой обратной стороной колонии. В популяции всегда имеется до 5% светло-серых колоний с бежевой обратной стороной. Край колоний неровный с белым ободком. Поверхность колонии складчатая. В центре колонии имеется возвышение, иногда с кратером. К десятому дню роста на поверхности колонии образуются белые бархатистые включения.

В табл. 1 представлены данные о цвете воздушного и субстратного мицелия, интенсивности спороношения, а также о наличии или отсутствии растворимых пигментов на различных органических и синтетических агаризованных средах.

Сведения о физиолого-биохимических признаках суммированы в табл. 2.

Максимальное накопление авермектинов наблюдается на 5-7-е сутки при 28^оС и скорости растворения кислорода 1,0-1,2 мМоль О₂/л/мин.

Антагонистические свойства.

Мицелиальные экстракты вызывают гибель нематод, относящихся к родам: Haemonehus, Trichostronglus, Ostrertagis, Nematodimes, Coopema, Ascams, Bunostomum, Oesophagostonum, Chabertia, Triehuris, Strongylus, Trichonema, Dictyocanlus, Capillaria, Meterakis, Toxocara, Oxyuris, Ancylostama, Uncinaria, Toxascaris, Parascaris, Ascoridia.

Также их действие губительно для клещей, афидов, вшей, блох, мух, тараканов, двукрылых и прямокрылых вредителей, платяной моли, ковровых и обойных жучков.

Предлагаемый штамм иллюстрируется следующим примером.

Споры штамма S. avermitilis-ВНИИСХМ-54 выращивают на овсяном агаре в течение 10 суток при 28 ± 1^оС. Кусочек агаровой среды со спорами вносили в качалочные колбы емкостью 750 мл, содержащие 75 мл среды следующего состава, глюкоза 4,0; соевая мука 0,6; белково-витаминный концентрат 1,0; кукурузный экстракт 0,3; СаСО₃ 0,1; К₂НРО₄ 0,06; вода водопроводная. Глюкозу стерилизуют отдельно при 0,5 атм 30 мин, она вносится в колбы в момент засева. Остальные компоненты стерилизуют при 0,8 атм 40 мин. Значение рН до стерилизации 6,2.

Колбы устанавливают на качалку с числом оборотов 220 в минуту и выращивают инокулят при температуре 28 ± 1^оС в течение 24 ч. Затем инокулят в количестве 5% передают в колбы с ферментационной средой следующего состава, глюкоза 7,0; соевая мука 0,6; белково-витаминный концентрат 1,0; кукурузный экстракт 0,3; СаСО₃ 0,1; К₂НРО₄ 0,06; вода водопроводная. Значение рН до стерилизации 6,2. Глюкозу стерилизуют при 0,5 атм 30 мин, а остальные компоненты при 0,8 атм 40 мин. Глюкозу вносят в колбы в момент засева среды инокулятом.

Ферментацию проводили в течение 168 ч при 28^оС. Авермектины выделяли из мицелия следующим образом. Вначале отделяли мицелий на центрифуге при 3000 об/мин в течение 10 мин. К влажному осадку, полученному из 10 мл культуральной жидкости, добавляли 10 мл охлажденной водопроводной воды, тщательно перемешивали при 3000 об/мин 5 мин. К влажному промытому осадку добавляли 10 мл этанола и проводили экстракцию авермектинов при комнатной температуре при постоянном перемешивании в течение 20 мин. После отделения мицелия при 3000 об/мин в течение 5 мин в центрифугах определяли общее содержание и компонентный состав авермектинов методом тонкослойной хроматографии с количественной оценкой метаболитов в пятнах на хроматограмме с помощью сканирующего спектрофотометра КМ-3 фирмы "Opton" (Австрия) при длине волны 244 нм (максимуме поглощения авермектинов). Хроматографическое разделение осуществляли на пластинах силикагеля G-60 фирмы "Merk" без люминофора в системе растворителей гексан: ацетон:метанол (14,0:6,0:0,5). Концентрацию авермектинов определяли по уравнениям калибровочных кривых для авермектинов А₂ и В₁.

Среднее содержание авермектинов в мицелии S. avermitilis-ВНИИСХМ-54 составляет 1500 мкг/мл при размахе изменчивости 1200-1800 мкг/мл. Компонентный состав авермектинов следующий, группа А₁ (А_1а + А_1в) 18,0 ± 1,85; А₂(А_2а+А_2в) 26,32 ± 1,62; В₁(В_1а+В_1в) 36,75 ± 1,35 и В₂(В_2а+ В_2в) 18,88 ± 1,64.

Известный штамм S. avermitilis-51 продуцирует в среднем 700 мкг/мл авермектинов.

Таким образом, предлагаемый штамм продуцент авермектинов S. avermitilis-ВНИИСХМ-54 позволяет получать авермектинов в два раза больше, чем известный штамм S. avermitilis-51.

Использование: микробиологическая промышленность, касается производства антипаразитарных препаратов, действующим веществом которых являются авермектины. Сущность изобретения: штамм Streptomyces avermitilis-ВНИИСХМ-54 получен путем естественного отбора из популяции штамма Streptomyces avermitilis-51. Штамм N 54 продуцирует в два раза больше авермектинов по сравнению с известным штаммом. Процентное содержание наиболее активного вещества авермектина В_1 а достигает более 35%. Штамм Streptomyces avermitilis-ВНИИСХМ-54 депонирован в коллекции микроорганизмов ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии (Санкт-Петербург) под номером Streptomyces avermitilis-ВНИИСХМ-54. 2 табл., 1 ил.

Штамм актиномицета Streptomyces avermitilis ВНИИСХМ-54 - продуцент авермектинов.