ШТАММ STREPTOMYCES CINNAMONENSIS - ПРОДУЦЕНТ МОНЕНЗИНА Российский патент 1996 года по МПК C12P1/06 C12P1/06 C12R1/465 

Изобретение относится к получению биологически активных веществ микробиологическим путем, а именно к производству препаратов с антикокцидиальными свойствами на основе монензина.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является штамм Streptomyces cinnamonensis ВНИИБТ-5 продуцент монензина (1,2). Монензин представляет группу родственных веществ, условно названных монензин А, В, С, D, отличающихся наличием различных радикалов в молекуле антибиотика, где А и В составляют 85-95% Комплекс монензинов ингибирует рост многих бактерий грибов, патогенных для животных и растений. Важнейшее свойство комплекса монензинов это способность предотвращать развитие кокцидиозов у домашней птицы. Продуктивность известного штамма составляет в среднем 5000 мкг/мл монензина (1,2).

Цель изобретения создание штамма, продуцирующего повышенное количество монензина.

Цель достигается путем естественной селекции из штамма Streptomyces cinnamonensis ВНИИБТ-5 и ступенчатым отбором наиболее активных вариантов по признаку монензинобразование, которое оценивают с помощью химического и биологического тестов (схема получения штамма представлена на чертеже).

Предлагаемый штамм (лабораторное название Str. cinnamonensis 3149) депонирован в коллекции микроорганизмов ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии (г. Санкт-Петербург) под номером Streptоmyces cinnаmonensis ВНИИСХМ-55.

Предлагаемый штамм характеризуется следующими культурально-морфологическими признаками.

Микроморфологические признаки штамма. Культура имеет неспиральные спороносцы, расположенные моноподиально.

Макроморфологические признаки штамма. На минеральном агаре I (Гаузе-I) (28^оС; рН 7,2-7,4; возраст 21 день) образуются плоские колонии с ровными краями белого цвета. Центр четко выраженный, выпуклый в некоторых колониях несколько изрезан. Спороношение умеренное. Обратная сторона темно-коричневая, в центре со светло-коричневыми краями. В агаре светлый пигмент, выступающий за края колонии до 8 мм. На овсяном агаре (28^оС; рН 7,2; возраст 21 день) образуются плоские колонии с несколько вогнутым центром. Цвет колонии белый или перемежающиеся кольца белого цвета с серыми, или светло-кремовыми кольцами. Край колоний неровный. Спороношение умеренное. Обратная сторона темно-коричневая. Пигмент в среде не обнаружен. На органическом агаpе 2 (Гаузе-2) (28^оС; рН 7,0-7,2; возраст 21 день) образуются плоские колонии кремового цвета с ворсинчатым центром. Края колонии неровные. Спороношение умеренное. Обратная сторона колоний светло-коричневая, без пигмента в агаре. На крахмальном (глюкозо-нитратном) агаре (28^оС; рН 7,0; возраст 21 день) образуются плоские колонии белого цвета с неровными краями. Спороношение умеренное. Обратная сторона темно-коричневая со светлым пигментом в агаре, выступающим за края колонии до 2 мм. На крахмально-аммиачном агаре (28^оС; рН 7,0; возраст 21 день) колоний не обнаружено. На глицерин-аспарагиновом агаре (28^оС; рН 7,0-7,4; возраст 21 день) образуются выпуклые колонии с вогнутым центром серого цвета с неровными краями. Спороношение умеренное. Обратная сторона серого цвета в центре с желтыми краями. Пигмент в агаре не обнаружен. На пептонно-дрожжевом агаре с железом (28^оС; рН 7,0-7,2; возраст 21 день) образуются плоские колонии белого цвета с неровными краями. Спороношение умеренное. Обратная сторона темно-коричневая в центре со светло-коричневыми краями. Пигмент в агаре не обнаружен.

Физиолого-биохимические признаки. Среди физиолого-биохимических признаков можно выделить следующие основные: аэроб, максимальный рост и споруляция культуры наблюдается при 30-37^оС. Оптимальное значение рН равняется 6,5-7,5. Максимальное накопление антибиотика наблюдается через 8-10 cут. Потребляет различные сахара ксилозу, мальтозу, декстрозу, фруктозу, рафинозу, инозитол, маннитол, салицин, (-) рибозу, (+) маннозу, глюкозу. Оптимальный источник глюкоза.

Антагонистические свойства. Продуцируемый штамм Streptomyces cinnamonеnsis ВНИИСХМ-55 монензин обладает высокой активностью против Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Mycobacterium avium, Streptococcus faealis, Lactobacillus casel, Leuconastor citrovorum, Proteus sp N 1, Vibrio metschnikovii, Alternaria solani, Botritis cinerea, Сolletotrichum pisi, Неlminthosporium sativum, Penicillum eхpansum. Важнейшее свойство манензина это способность предотвращать развитие кокцидиозов у домашней птицы.

Предлагаемый штамм иллюстрируется следующим примером.

Споры штамма Streptomyces cinnamonensis ВНИИСХМ 55 выращивают на агаризированной среде Гаузе I в течение 12 сут при 28^оС. Кусочек агаровой среды (1/10 часть косяка) со спорами вносили в качалочные колбы емкостью 750 мл, содержащие 80 мл посевной среды следующего состава в соевая мука 1,5; глюкоза 0,5; (амило)-декстрин 2,0; дрожжи пивные сухие 0,25; СаСО₃ 0,3; вода дистиллированная до 100% Значение рН стерилизации 6,5. Стерилизуют при 0,8 атм 30 мин.

Колбы устанавливают на качалку с числом оборотов 220 в 1 мин и выращивают инокулят при 28^оС в течение 40 ч. Затем инокулят в количестве 5% переносят в колбы с ферментационной средой следующего состава в соевая мука 3,3; глюкоза 3,7; СаСО₃ 0,35; Na₂SO₄ 0,22; NaNO₃ 0,22; Al₂(SO₄)₃ 0,07; K₂HPO₄ 0,0075; FeSO₄ 0,015; MnCl₂ ·4H₂O 0,044; аскорбиновая кислота 0,0019, дистиллированная вода до 100% Объем среды в колбе 80 мл. Стерилизуют при 0,8 ати 30 мин. В момент засева среды инокулятом и через каждые двое суток по ходу процесса вносится соевое масло по 1-2% один раз в 2 сут. Соевое масло стерилизуется при 0,8 ати 30 мин.

Ферментацию проводили в течение 8-10 cут при 28^оС на качалке с числом оборотов 220 в 1 мин. Монензин выделяли из культуральной жидкости следующим образом. К 1 мл культуральной жидкости добавляли 19 мл 96% этилового спирта и проводили экстракцию монензина при комнатной температуре и постоянном перемешивании в течение 60 мин. После экстракции смесь центрифугируют при 3000 оборотах в 1 мин в течение 10 мин и надосадочную жидкость используют для определения монензинобразования с помощью биологического и химического методов.

Биологическую активность монензина определяют с помощью тест культуры Bacillus subtilis АТСС 6633. Для этого в колбу с жидкой агаризованной средой следующего состава натрий лимоннокислый 0,4; NH₄NO₃ 0,125; Nа₂НРО₄ ·12Н₂О 0,025; MgSO₄ 0,046; квасцы железо-аммонийные 0,005; KH₂PO₄ 0,12; NaCl 0,1; глюкоза 1,6; агар-агар 2,0; дистиллированная вода до 100% (стерилизация 0,8 ати 30 минут) и температурой 60^о вносят 6 мл АТСС 6633, 5 10(6) спор Bacillus subtilis на 1000 мл агаризованной среды. После заражения разливают агаризованную среду по 17 мл на чашки Петри и после того, как агар застыл, делают пробойником лунки по трафарету. Исследуемый раствор монензина разводят в дистиллированной воде и используют для закапывания по 100 мкл в лунки в чашках Петри.

Стандарт монензина растворяют в спирте из расчета 1 мг/мл. Далее делают ряд разведений в дистиллированной воде, чтобы получился раствор с концентрациями 1-5 мкг/мл. Эти растворы закапывают по 100 мл в лунки в чашках Петри. Чашки Петри термостатируют при 37^оС в течение 18-20 ч и затем измеряют зоны задержки роста. При проверке продуктивности 100 вариантов предлагаемого штамма продуцента монензина Streptomyces cinnamonensis ВНИИСХМ-55 биологическая активность составила в среднем 26500 единиц (1 единица равна 1 мкг/мл монензина), размах изменчивости составил 2000 единиц.

Химический способ обнаружения монензина основан на образовании красной окраски при реакции с ванилином в присутствии серной кислоты. После нагревания образца, содержащего монензин, в течение 25 мин при 60^оС на водяной бане с 3% раствором ванилина в 0,5%-ном растворе серной кислоты в бутаноле появляется красная окраска, интенсивность которой измеряют при длине волны 518 нм. Стандартную кривую строят с использованием раствора, содержащего 1,0 мг/мл кристаллического монензина. Линейная зависимость сохраняется в пределах 10-100 мкг/мл антибиотика. Чувствительность метода составляет 1 мкг/мл.

При проверке 100 вариантов предлагаемого штамма продуцента монензина Streptomyces cinnamontnsis ВНИИСХM-55 продуктивность составила в среднем 28000 мкг/мл, размах изменчивости составил 2000 мкг/мл.

Таким образом, предлагаемый штамм продуцент монензина Streptomyces cinnamonensis ВНИИСХМ-55 позволяет получать культуральную жидкость, содержащую в 5,6 раза больше монензина по сравнению с известным штаммом ВНИИБТ-5.

Использование: микробиологическая промышленность. Сущность изобретения: штамм Streptomyces cinnamonensis ВНИИСХМ-55 получен из популяции штамма Streptomyces cinnamonensis ВНИИБТ-5 путем естественной селекции. Предлагаемый штамм продуцирует более, чем в 5 раз больше монензина по сравнению с известным штаммом. 1 ил.

Штамм Streptonyces cinnamonensis ВНИИСХМ-55 продуцент монензина.