СПОСОБ ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА Российский патент 1996 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для обнаружения реакции антиген-антитело.

Известен способ постановки реакции связывания комплемента [1] включающий тестовую и индикаторные системы антиген-антитело, причем, в качестве индикаторной системы гемологическую систему сенсибилизированные специфическими антителами эритрациты барана, лизирующиеся в присутствии комплемента. Учет реакции осуществляется по степени задержки гемолиза. Недостатком известного способа является использование в индикаторной системе эритроцитов барана, связанное со сложностью их получения, хранения и стандартизации.

Техническим результатом является упрощение способа постановки реакции связывания комплемента.

Технический результат достигается тем, что в качестве индикаторной системы использованы клетки, обладающие собственной подвижностью, а обнаружение наличия или отсутствия реакции связывания комплемента производят по изменению подвижности клеток индикаторной системы.

Указанная последовательность существенных отличительных признаков, позволяющих упростить способ постановки реакции связывания комплемента, не обнаружена в известных технических решениях, что позволяет сделать вывод о новизне предлагаемого технического решения.

Способ осуществляется следующим образом.

Проводят приготовление тестовой системы. Для этого смешивают растворы специфических антигена и антител с раствором комплемента в адекватных концентрациях. Проводят приготовление контрольной тестовой системы. Для этого смешивают растворы неспецифических антигена и антител с раствором комплемента в адекватных концентрациях.

Смеси инкубируют в течение не менее часа. Проводят приготовление индикаторной системы. Для этого смешивают суспензию клеток, обладающих собственной подвижностью с раствором специфических антител. Смесь инкубируют 10-15 мин. Смешивают растворы тестовой и контрольной тестовой систем с раствором индикаторной системы. Оценивают наличие или отсутствие реакции антиген-антитело по изменению подвижности суспензии клеток. В случае, если реакция антиген-антитело имеет место, наблюдается торможение снижения подвижности суспензии клеток. В случае, если реакция антиген-антитело отсутствует, торможение снижения подвижности клеток не наблюдается.

П р и м е р. Рассмотрим определение наличия липополисахаридов антигенов, ответственных за пирогенность различных растворов, материалов и изделий. В качестве носителя антигена липополисахарида используют водную вытяжку из полимерного изделия. Определение пирогенности вытяжки из полимерного изделия проводят методом реакции связывания комплемента. Для проведения теста используют оттитрованные свежезамороженные ингредиенты.

Приготавливают раствор антител, для этого замороженную гранулу антител из сосуда Дьюара помещают в пробирку. Приготавливают раствор комплемента, для этого гранулу замороженного комплемента помещают в пробирку. Приготавливают опытный образец. Для этого в пробирку наливают 1 мл испытуемого образца вытяжки, 10 мкл антител и 30 мкл комплемента. Содержимое пробирки перемешивают встряхиванием. Приготавливают контрольный образец с отрицательной реакцией. Для этого в пробирку с притертой пробкой наливают 1 мл апирогенного стерильного 0,9%-ного раствора хлорида натрия, 50 мкл антител, 30 мкл комплемента. Приготавливают контрольный образец с положительной реакцией. Для этого в пробирку наливают 1 мл апирогенного стерильного 0,9%-ного раствора хлорида натрия, 1 МПД раствора антигена, 10 мкл антител, 30 мкл комплемента. Содержимое пробирки перемешивают встряхиванием. Опытный и контрольные образцы помещают в термомостат при температуре 37^оС. Через 1 ч опытный и контрольный образцы вынимают из термостата. Приготавливают биосенсорную систему. Для этого отмеряют пипеткой в пробирки по 0,4 мл разбавителя и ставят их в водяную баню при температуре 40±0,5^оС. Охлажденным до температуры жидкого азота длинным анатомическим пинцетом извлекают из сосуда Дьюара гранулу спермы и быстро опускают в нагретый раствор. Сразу после размораживания в каждую пробирку добавляют 40 мкл антител, тщательно перемешивают встряхиванием и выдерживают 5 мин. Содержимое пробирок сливают в одну и перемешивают встряхиванием. Приготавливают рабочие образцы. Для этого в каждую пробирку контрольной и опытной серий добавляют по 0,2 мл маточного раствора спермы. Подготавливают пробы к исследованию на приборе. Для этого каждый рабочий образец переносят в кювету, которую накрывают покровным стеклом. Излишки рабочего раствора снимают с кюветы фильтровальной бумагой. Затем кюветы устанавливается в кюветодержатель прибора для оценки подвижности клеток. Проводят накопление экспериментальных данных. Каждое оцененное значение показателя подвижности выдается на встроенный десятичный индикатор и печатающее устройство. По достижении нулевых значений показателя подвижности на всех кюветах производится остановка процесса накопления данных. Проводят обработку экспериментальных данных. Для каждого образца вычисляется выживаемость:
S m_i где m_i m_i-ое значение показателя подвижности;
i текущий номер оценки показателя подвижности.

Проводят оценку результатов испытаний контрольных образцов. Если для контрольных образцов с положительной () и отрицательной () реакцией выполняется соотношение
> где и среднее арифметическое значение выживаемости соответствующих выборок образцов, то оценивают результаты испытаний образцов. Если >>, то образец считается апирогенным, произошла реакция связывания комплемента, в вытяжке не обнаружен липополисахарид. Если >S^кп, то образец признается пирогенным, реакция связывания комплемента не произошла, в вытяжке обнаружен липолисахарид, где среднее арифметическое значение выживаемости испытуемого образца. Предлагаемый способ обладает рядом преимуществ. Использование в индикаторной системе клеток, обладающих собственной подвижностью позволяет применить сперму крупного рогатого скота, замороженную в жидком азоте, что позволяет заготовить этот компонент индикаторной системы в необходимом количестве и хранить его неограниченно долго. Время его приготовления для использования не превышает 5 мин. Технология заготовки замороженной спермы крупного рогатого скота хорошо отработана и широко распространена во всем мире. Поскольку для применения в индикаторной системе можно применять сперму, заготовленную для искусственного осеменения и забракованную по потомству, стоимость этого компонента крайне низкая. Использование для обнаружения реакции изменения подвижности суспензии сперматозоидов дает возможность проводить обнаружение или визуально под микроскопом или использовать серийные приборы для оценки подвижности клеток. Кроме того, использование спермы крупного рогатого скота позволяет комплексировать данный способ с технологией контроля токсичности "in vitro". Следует отметить, что индикаторная система на основе сперматозоидов крупного рогатого скота оказалась на порядок чувствительнее, чем на основе эритроцитов барана.

Использование: в медицине, в частности в иммунологии. Техническим результатом является упрощение способа постановки реакции связывания комплементов. Сущность изобретения: смешивают растворы специфических антигена и антител с раствором комплемента с образованием комплекса комплемент-антиген-антитело с последующим взаимодействием оставшегося несвязанного комплемента с индикаторной системой (суспензией сенсибилизированных сперматозоидов), а о связывании комплемента судят по изменению подвижности сперматозоидов.

СПОСОБ ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА, включающий контактирование антигена с антителами в присутствии комплемента, образование комплексов комплемент-антиген-антитело с последующим взаимодействием оставшегося несвязанного комплемента с индикаторным агентом, отличающийся тем, что в качестве индикаторного агента используют сенсибилизированные сперматозоиды, а о связывании комплемента судят по изменению подвижности сперматозоидов.