СПОСОБ ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ ЗАДЕРЖКИ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ГЕМОЛИЗА Российский патент 2009 года по МПК G01N33/53 

Предлагаемое изобретение относится к области медицины и ветеринарии.

Предназначено для установления этиологии инфекционных заболеваний в реакциях серодиагностики, сероидентификации и сероиндикации.

Из аналогов известны такие серологические реакции, как агглютинации, преципитации и непрямой гемагглютинации (Никитин В.М. Справочник серологических реакций. - Кишинев, 1977), задержки деструкции гомологичных эритроцитов, а также способ выявления аутоантител, препятствующих лизису эритроцитов (решение о выдаче патента на изобретение от 16.02.07 по заявке №2005108127 от 22.03.2005).

Одни из этих реакций не дают возможности диагностировать вирусные и бактериальные инфекции, вызываемые токсигенными микробами, другие сложны в постановке и являются трудоемкими, а «Способ выявления аутоантител, препятствующих лизису эритроцитов», позволяет судить только об иммунном статусе организма. Реакция токсического гемолиза устраняет эти недостатки, является универсальной для индикации любых видов антигенов или антител.

Суть изобретения заключается в том, что истощенная специфическим антигеном иммунная сыворотка теряет способность защищать гомологичные эритроциты от их лизиса гемолитическими ядами.

Наиболее близкой к предлагаемой реакции является реакция связывания комплемента, которая и была выбрана в качестве прототипа (Никитин В.М. Справочник серологических реакций. - Кишинев, 1977. - С.172-182).

Эта реакция является сложной в постановке и относительно дорогой. Для ее постановки кроме сыворотки, антигена и эритроцитов барана необходимы комплемент и гемолитическая сыворотка, что удорожает анализ. Перед постановкой этой реакции приходится дополнительно ставить реакции лизиса для определения титров антигена, комплемента и гемолитической сыворотки, что делает ее трудоемкой.

Предлагаемое изобретение устраняет эти недостатки.

Цель создания изобретения - повышение точности результатов анализа и универсальность сероидентификации и сероиндикации заболеваний, а также снижение стоимости и трудоемкости проведения анализа.

Эта цель достигается тем, что индикатором гемолиза служат гомологичные эритроциты, а для лизиса эритроцитов используется гемотоксин или желчь.

Принцип постановки реакции заключается в том, что берут иммунную сыворотку и вносят туда специфический антиген, гомологичные сыворотке эритроциты и выдерживают в течение 30 минут, а затем добавляют гемотоксин или желчь. Если антиген соответствуют сыворотке, то антитела к возбудителю будут нейтрализованы.

В то же время антитела к собственным гомологичным эритроцитам перестают защищать их от лизиса, тогда как в контрольной пробирке, где вместо антигена внесен в том же количестве ИРНХ (изотонический раствор хлорида натрия), лизиса при всех равных условиях не происходит.

Реакция может ставиться в двух вариантах.

Вариант 1 (обнаружение антител к возбудителю заболевания)

У обследуемого человека или животного берут кровь в пробирку. После образования фибринного сгустка отсасывают сыворотку, сгусток удаляют, предварительно встряхнув пробирку для высвобождения некоторого количества эритроцитов. Эритроциты отмывают в изотоническом растворе хлорида натрия (ИРХН) два раза и готовят из них 3%-ную взвесь в ИРХН.

Сыворотку наливают в две пробирки в количестве 1-2 мл. В опытную пробирку добавляют 1/10 часть антигена (0,1-0,2 мл), а в контрольную пробирку столько же ИРХН.

Пробирки помещают на 30 минут в термостат при температуре 37°С.

Затем в обе пробирки вносят по 2-3 капли 3%-ной взвеси эритроцитов обследуемого и снова ставят на 30 минут в термостат.

После этого в каждую пробирку добавляют гемолитический яд или гемотоксин, например, 2-3 капли раствора желчи в концентрации 1/100 (рабочий раствор), и наблюдают до появления гемолиза в опытной пробирке (1-3 минуты).

Гемолиз в опытной пробирке будет говорить о наличии в сыворотке антител, соответствующих антигену.

Вариант 2 (обнаружение антигена возбудителя заболевания)

В две пробирки наливают диагностическую сыворотку по 1-2 мл и добавляют 1/10 часть антигена (взвеси выделенной бактериальной культуры, культуральной жидкости с вирусами и пр.). Пробирки помещают на 30 минут в термостат при температуре 37°С, а затем добавляют по две капли 3%-ной взвеси эритроцитов кролика (если диагностическая сыворотка кроличья) или эритроцитов барана (если диагностическая сыворотка баранья) и снова ставят на 30 минут в термостат.

После этого в каждую пробирку добавляют гемолитический яд, или гемотоксин, например, 2-3 капли раствора желчи в концентрации 1/100 (рабочий раствор), и наблюдают до появления гемолиза в опытной пробирке (1-3 минуты).

Гемолиз в опытной пробирке будет свидетельствовать о наличии в исследуемом материале антигена, соответствующего антителам в диагностической сыворотке.

Пример 1

Обнаружение антител к бруцеллам в сыворотках крови коров

В опыт было взято 5 сывороток крови вакцинированных коров, дававших положительную реакцию связывания комплемента с бруцеллезным антигеном и 5 сывороток с отрицательной реакцией (контрольная группа).

Сыворотки разливались в агглютинационные пробирки по 1 мл, затем в каждую пробирку вносилось по 0,1 мл бруцеллезного антигена для реакции связывания комплемента. Пробирки помещались в термостат на 30 минут при температуре 37°С.

Из пробирок с остатками сывороток и эритроцитами на дне после встряхивания удалялся сгусток, остатки объединялись для получения эритроцитной взвеси. После двукратного отмывания из них приготавливалась 3%-ная взвесь.

В пробирки с исследуемыми сыворотками, вынутыми из термостата, закапывалось по 2 капли взвеси эритроцитов и пробирки снова помещались в термостат на 30 минут, после чего в каждую из них вносилось по 2-3 капли рабочего раствора желчи. Через 3 минуты учитывался результат. Данные проведенных опытов приведены в таблице 1.

Таблица 1
Результаты реакции задержки токсического гемолиза №№ обследумых сывороток Опыт (вакцинированные коровы с положительной РСК на бруцеллез) Контроль (невакцинированные коровы с отрицательной РСК на бруцеллез) 1 + - 2 + - 3 + - 4 + - 5 + - Примечание. «+» - наличие гемолиза (положительная реакция);
«-» - отсутствие гемолиза (отрицательная реакция).

Как видно из таблицы 1, иммунные сыворотки, содержащие антитела к бруцеллам после истощения их бруцеллезным антигеном, не предохранили гомологичные эритроциты от лизиса их желчью, тогда как сыворотки неистощенные (контрольные) предотвратили гемолиз, что полностью соответствует данным классического анализа - реакции связывания комплемента.

Пример 2

Обнаружение аутоантител к стафилококку в сыворотках крови больных

В опыт было взято 6 сывороток крови больных микробной экземой, у которых из раневого отделяемого был выделен золотистый стафилококк, а в качестве контроля - 6 сывороток крови здоровых (доноров).

Опытные сыворотки разливались в агглютинационные пробирки по 1 мл, затем в каждую пробирку вносилось по 0,1 мл гретой при 70°С в течение 30 минут взвеси в ИРХН соответствующего аутоштамма стафилококка выделенного от больного (1×10⁹), то есть приготавливался диагностикум.

Пробирки помещались в термостат на 30 минут при температуре 37°С.

Из пробирок с остатками сывороток и эритроцитами на дне после встряхивания удалялся сгусток, остатки объединялись для получения эритроцитной взвеси. После двукратного отмывания из них приготавливалась 3%-ная взвесь.

В пробирки с исследуемыми сыворотками, вынутыми из термостата, закапывалось по 2 капли взвеси эритроцитов, и пробирки снова помещались в термостат на 30 минут, после чего в каждую из них вносилось по 2-3 капли рабочего раствора желчи. Через 3 минуты учитывался результат.

Для сравнения на содержание антител к стафилококку были обследованы доноры.

В контрольные пробирки с 1 мл сывороток крови доноров также вносилось по 0,1 мл этого диагностикума, а через 30 минут экспозиции в термостате по 2 капли смеси их эритроцитов.

Пробирки также выдерживались 30 минут при 37°С в термостате, после чего добавлялся раствор желчи и через 3 минуты учитывался результат.

Данные проведенных опытов приведены в таблице 2.

Таблица 2
Сравнительная оценка результатов реакции задержки токсического гемолиза Сыворотки обследуемых Результаты 1 2 3 4 5 6 Больных + + + + + + Здоровых - - - - - - Примечания. 1. «+» - наличие гемолиза (положительная реакция): «-» - отсутствие гемолиза (отрицательная реакция). 2. 1, 2, 3, 4, 5, 6 - номера проведенных опытов.

Результаты опытов, приведенные в таблице 2, говорят о наличии в сыворотке больных антител к стафилококку.

Пример 3

Сероидентификация(индикация)вируса гриппа

Противогриппозные диагностические кроличьи сыворотки H₂N₂ и В, разводились 1/10 и наливались в две пробирки по 1 мл. В обе пробирки вносилось по 0,1 мл аллантоисной жидкости куриного эмбриона, зараженного вирусом гриппа H₂N₂, и пробирки помещались в термостат на 30 минут при температуре 37°С.После этого в них вносилось по две капли 3%-ной взвеси кроличьих эритроцитов и пробирки снова помещались на 30 минут в термостат.

После этого в каждую пробирку добавляли по 2 капли раствора желчи. Через 3 минуты наступал лизис в опытной пробирке при его отсутствии в контрольной (с диагностической сывороткой против вируса гриппа В), что говорило о наличии в исследуемом материале вируса гриппа H₂N₂. Опыт повторялся многократно.

Параллельно ставилась реакция связывания комплемента (контроль).

Данные опытов представлены в таблице 3.

Таблица 3
Сравнительная оценка результатов реакции задержки цитотоксического гемолиза и реакции связывания комплемента Сыворотки против вирусов Реакция задержки тотоксического гемолиза Реакция связывания комплемента 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 Н₂N₂ + + + + + + + + + + + + В - - - - - - - - - - - - Примечания. 1. «+» - наличие гемолиза (положительная реакция);
«-» - отсутствие гемолиза (отрицательная реакция).
2. 1, 2, 3, 4, 5, 6 - номера проведенных опытов.

Результаты опытов, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о полном совпадении результатов реакции задержки токсического гемолиза и реакции связывания комплемента.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Никитин В.М. Справочник серологических реакций. - Кишинев, 1977. С.172-182.

2. Способ выявления аутоантител, препятствующих гемолизу эритроцитов. Решение о выдаче патента на изобретение от 16.02.07 по заявке №2005108127 от 22.03.2005.

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, а именно к иммунологии. Сущность способа постановки реакции задержки цитотоксического гемолиза: в реакции участвуют специфические антитела и антиген, в качестве индикаторной системы используют эритроциты, гомологичная к ним сыворотка и гемотоксин (желчь). Истощенная специфическим антигеном иммунная сыворотка теряет способность защищать гомологичные эритроциты от их лизиса гемолитическими ядами или гемотоксинами. Обнаружение антигена возбудителя заболевания в исследуемом материале производится путем регистрации лизиса гомологичных эритроцитов гемолитическим ядом - желчью - после истощения диагностической иммунной сыворотки искомым антигеном. Наряду с этим возможно обнаружение антител в исследуемой сыворотке крови больного после ее истощения известным антигеном. Предлагаемая серологическая реакция может служить простым и доступным методом диагностики инфекционных заболеваний. 3 табл.

Способ постановки реакции задержки цитотоксического гемолиза с применением иммунной сыворотки, антигена и индикатора гемолиза, отличающийся тем, что в качестве индикатора гемолиза применяют гомологичные эритроциты, причем для лизиса эритроцитов применяют гемотоксин, в качестве которого используют желчь.