УСТРОЙСТВО ДЛЯ АВТОНОМНОГО АНАЭРОБИОЗА МИКРООРГАНИЗМОВ РАЗОВОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ Российский патент 1996 года по МПК C12M1/24 

Изобретение относится к микробиологии, а именно к устройствам для работы с микроорганизмами.

Анаэробные микроорганизмы (анаэробы) составляют подавляющее большинство нормальной микрофлоры человеческого тела. Изучение микроорганизмов этой группы трудоемкий в методическом и техническом плане раздел микробиологии, основным препятствием которого является быстрая гибель облигатных (обязательных) анаэробов при контакте с кислородом воздуха. Критическое время выживания у большинства анаэробных микроорганизмов не превышает 15-60 мин, именно поэтому высеваемость анаэробов непосредственно зависит от времени контакта бакматериала с воздухом и составляет по данным различных авторов от 1,5 до 93% Создание условий анаэробиоза (бескислородной среды) являлось основной задачей в эволюции методологии изучения анаэробов. Ранее применяемые устройства: трубки и мерные пипетки, камеры с покровными стеклянными и полимерными пластинами не получили распространения из-за контакта бакматериала с воздухом при пересевах, наличия глубинного роста колоний микроорганизмов. Не получили широкого распространения и устройства для посевов уколом в плотную питательную среду, дающие глубинный рост, слияние колоний, непригодные к использованию непрозрачных питательных сред. Лабораторные устройства типа перчаточных камер, представляющие собой герметичные газонаполняемые аппараты с возможностью манипулирования во внутpеннем объеме, отличаются сложностью, необходимостью дополнительного газообменного оборудования.

В настоящее время известны 3 группы устройств, применяемых в практике, принципиально различающиеся по способу создания условий анаэробиоза. Первую группу представляют контейнеры и микроконтейнеры жесткой конструкции, снабженные герметизирующими крышками, патрубками для откачки воздуха и введения газа. Устройствам этой группы полностью соответствует отечественный микроанаэростат МИ-752. Это устройство состоит из цилиндрического стакана и обода, насаженного на его открытый конец, резиновой прокладки, крышки. Крышка имеет патрубок с вентилем, вакуум-манометр, скобу и затяжной винт, прижимающий крышку к фланцу обода. Условия анаэробиоза в данном устройстве создаются путем вакуум-замещения воздуха на газ: водород, азот, CO₂ или смесь из них. Достоинством устройств данной группы является относительная доступность, возможность выделения чистых культур, использование для посевов чашек Петри и пробирок. Из недостатков необходимо указать следующие: контакт бакматериала с кислородом воздуха при пересевах, необходимость вакуумного и газонаполнительного оборудования, источников газа, тpудоемкость в обслуживании.

Устройства для анаэробиоза второй группы используют поглощение кислорода из камеры или контейнера активными химическими соединениями, например поглощающая кислород система для анаэробиоза, запатентованная в США. Данный подход к решению проблемы позволяет создать более компактные устройства, пригодные для хранения и транспортировки бакматериала.

На этом принципе создано устройство, поддерживающее анаэробные микроорганизмы, представляющее собой стеклянный контейнер с горловиной, в котором размещены емкость с химическим поглотителем кислорода, пробирка для размещения бакматериала, проволочная петля с марлевым тампоном и жесткосвязанная с ними пробка. Химический поглотитель перед использованием активируется водой, пробирка, соответствующая диаметру горловины, временно герметизирует контейнер. Бакматериал забирают на тампон, петлей переносят в пробирку, последнюю опускают внутрь контейнера, окончательно герметизируя горловину пробкой. Данную конструкцию можно использовать как устройство для забора, временного хранения и транспортировки бакматериала.

Однако данное устройство не обеспечивает анаэробиоза при пересевах, а газовая среда в контейнере представлена преимущественно азотом, в то время как углекислый газ необходим для жизнедеятельности многих анаэробов в количестве не менее 10% объема газовой среды.

Третья группа устройств для анаэробиоза используeт принцип вытеснения воздуха из рабочего объема контейнера посредством химического генератора газа, размещаемого в контейнере. Устройства такого типа называют Gaspak и используют в лабораторной системе изучения микроорганизмов, производимой фирмой BBL Microbiology". Она предлагает использование устройства, состоящего из прозрачного пластикового стакана с завинчивающейся крышкой, представляющего собой герметичный контейнер емкостью 100 дм³, условия анаэробиоза в котором создаются химическим генератором CO₂, размещенным в заменяемых пакетах. Каждый такой пакет содержит прессованную сухую навеску натрия бикарбоната и лимонной кислоты, систему капиллярных дорожек для заполнения водой и прокладку из фильтровальной бумаги, обеспечивающую длительность работы химического генератора. Активация химических компонентов достигается введением в пакет 10 мл дистиллированной воды после загрузки контейнера посевами непосредственно перед герметизацией.

Данная система анаэробиоза привлекает внимание бактериологов, поскольку имеет значительные методологические преимущества перед ранее описанными: позволяет размещать в условиях анаэробиоза чашки Петри, штативы с пробирками, флаконы со средами, осуществлять визуальный контроль за состоянием посевов, обходиться без дополнительного газонаполнительного оборудования.

Однако с описанном устройстве не устранены контакт бакматериала с кислородом воздуха при пересевах, необходимость нарушения условий анаэробиоза при внесении или изъятии одного посева, необходимость сочетания с другими устройствами для забора и транспортировки бакматериала.

Предлагаемое устройство для автономного анаэробиоза, разового использования, отличается тем, что герметичный контейнер выполнен в виде двухкамерного вертикального цилиндра с двумя разновеликими патрубками и герметизирующими колпачками на них, нижняя камера которого сообщается с просветом патрубков и предназначена для размещения бакматериала и питательной среды, верхняя камера на 2/3 cнизу заполнена химическим генератором и ограничительными прокладками, а оставшаяся часть сообщается с просветом одного из патрубков посредством технологического окна.

На чертеже показано предлагаемое устройство.

Устройство выполнено из стандартных трубчатых материалов трех типоразмеров, диаметром 1,4; 2,0; 8,1 мм, соответствующих ТУ 64-3-123-78 и ТУ 64-3013-81, из пластиката медицинского, представляющего собой прозрачный и эластичный полимер. Все элементы жестко соединены в единую герметичную микроконструкцию. Двухкамерный вертикальный цилиндр 1 выполнен из отрезка трубки большего диаметра D длиной 15D, внутренний объем которого поперечно поделен на камеры в соотношении 3:1 снизу. Два разновеликих патрубка 2 выполнены из отрезков трубки наименьшего диаметра длиной 8D и 6D. Они служат для инокуляции (всасывания) бакматериала, введения питательной среды и отведения избытка газа, водяных паров соответственно. Различная длина патрубков введена для удобства при инокуляции бакматериала, для предотвращения прямого заброса бакматериала и питательной среды из патрубка в патрубок, а также с целью их маркировки. Герметизирующие колпачки 3, жестко связанные с вершинами патрубков, предназначены для восстановления герметичности устройства после забора бакматериала и выполнены из отрезков трубки среднего диаметра длиной 2D, при этом диаметр патрубка и просвет колпачка обеспечивают плотное соединение. Нижняя камера 4 служит для размещения бакматериала и питательной среды и сообщается с просветом обоих патрубков. Верхняя камера 5 заполнена на 2/3 объема снизу химическим генератором 6 CO₂, представляющим собой равномерно смешанные навески порошкообразных компонентов: натрия бикарбоната и лимонной кислоты в весовом соотношении 1,31:1 (соответственно молярной массе), и ограничительными прокладками 7, выполненными из хлопчатобумажной ваты. Ограничительные прокладки препятствуют распространению компонентов химического генератора по всему объему камеры, накапливают водяной конденсат, обеспечивая длительность работы генератора. Технологическое окно 8 выполнено в одном из патрубков, предпочтительно в коротком (различие несущественно), площадью не менее двух просветов патрубка. Окно сообщает свободный объем верхней камеры с просветом патрубка и необходимо для поступления водяных паров к химическому генератору. Жесткие и герметичные соединения полимерных деталей в устройстве выполнены за счет швов 9 термосварки. С целью сохранения просветов патрубков во время сварки использованы монолитные цилиндрические протекторы соответствующего диаметра. Возможно использование других типов жестких соединений: склейка, литье, герметизация компаундом, этапная горячая формовка. Предварительная стерилизация деталей производится в 6%-ном растворе перекиси водорода при 48-52^оС в течение 3 ч с последующей сушкой горячим воздухом при температуре 75-87^оС до полного исчезновения влаги. Окончательная стерилизация парами абсолютного этанола 90 с, перед окончательной герметизацией устройства после сборки производится продувка CO₂ 30 мл.

В устройстве использован принцип вытеснения воздушной среды углекислым газом с испарительно-конденсационным механизмом активации химического генератора, обеспечивающим автономность газонаполнения. Исходя из этого нижняя камера выполняет функции испарителя, патрубок с технологическим окном транспортирует водяные пары, верхняя же камера их конденсирует. Ограничительные прокладки накапливают водяной конденсат, предотвращая быстрое истощение химического генератора. Герметизирующие колпачки обеспечивают наличие малого избыточного давления газа в камерах и сброс его избытков. Пороговое значение сброса по давлению зависит от глубины посадки колпачка на патрубок. При работе с устройством возможно использование двух режимов газонаполнения: форсированого и поддерживающего. Форсированный режим достигается введением в нижнюю камера питательной среды, подогретой до 37^оС, или изолированным термостатированием нижней камеры при 37,0^оС на водяной бане. В этом случае конденсат образуется спустя 2-3 мин после загрузки нижней камеры. Поддерживающий режим газонаполнения достигается термостатированием всего устройства при 37,0^оС или хранением при температуре 20,5-25,0^оС и относительной влажности не более 70% Данный режим обеспечивает работу химического генератора не менее 56 ч.

Контроль за условиями анаэробиоза в устройстве осуществляется при помощи цветного индикатора резазурина, который вводится в питательную среду из расчета 0,002 г на 1 л. При появлении кислорода в газовой среде индикатор окисляется, давая розовое окрашивание питательной среды. Порядок работы с устройством несложен, для его обеспечения требуется только общепринятое оборудование: этанол 96^о, спиртовая горелка, ножницы остроконечные, шприцы с иглами стерильные разового использования типа "Луер" емкостью 5 мл, зажим хирургический прямой типа "Бильрот", штатив для пробирок. Ножницы и зажим дополнительно стерилизуют в пламени горелки перед каждым использованием. Перед забором бакматериала патрубки и колпачки деконтаминируют этанолом 30 с. При вскрытии источника бакматериала длинный патрубок срезают по нижней границе колпачка, просвет патрубка погружают в бакматериал. Пальцевым давлением на нижнюю камеру вытесняют часть газа (2-3 пузырька), материал инокулируют в патрубок, устраняя давление на нижнюю камеру. Сразу за этим вскрывают ампулу с жидкой питательной средой для анаэробов, 1,0 мл которой забирают шприцем с иглой и вводят в длинный патрубок. Непосредственно перед введением срезают короткий патрубок по нижней границе колпачка. По окончании посева просвет колпачков вскрывается отсечением шва термосварки с одной стороны. Герметичность устройства восстанавливается плотной посадкой колпачков на вершины патрубков при помощи прямого хирургического зажима. Устройство с посевом помещали в вертикальном положении в штатив до перемещения в термостат.

При отработке и испытании методики посевов использовали жидкую питательную среду для анаэробов следующего состава: "Питательная среда для контроля стерильности сухая" производства МНИИВС им. И.И.Мечникова 33 г, твин 80-1,0 г, крахмал растворимый 160 г, гемин 0,001%-ный раствор в 0,1NaOH 1,0 мл, лизированная кровь 1,0 мл, вода дистиллированная до 1000 мл. Питательную среду стерилизовали автоклавированием 15 мин при 1 атм, разливали в ампулы по 2,0 мл в горячем виде, ампулы герметизировали и хранили в холодильнике при -6^оС. Перед использованием питательную среду регенерировали на водяной бане при 80^оС 20 мин, давая остыть до 37,0^оС перед введением в устройство.

При работе с устройством отмечены следующие положительные черты: время забора и пересева бакматериала не превышало 3 мин, порядок работы несложен и обеспечивается общепринятым оборудованием, а малый вес и габариты обеспечивают удобство при заборе, хранении, транспортировке и культивации в термостате.

Таким образом, предлагаемое устройство для автономного анаэробиоза, разового использования обеспечивает максимальное сокращение времени контакта с кислородом воздуха, упрощение методологии высевания анаэробов.

Использование: для анаэробного культивирования микроорганизмов при их исследовании. Сущность изобретения: устройство для автономного анэробиоза содержит герметичный контейнер, выполненный в виде двухмерного вертикального цилиндра с двумя разновеликими патрубками и герметизирующими колпачками на них, нижняя камера которого сообщается с просветом патрубков и предназначена для размещения бакматериала и питательной среды, верхняя камера на 2/3 снизу заполнена химическим генератором и ограничительными прокладками, а оставшаяся часть сообщается с просветом одного из патрубков посредством технологического окна. Устройство выполнено из полимерных трубчатых материалов, жестко соединенных в единую микроконструкцию, обеспечивающую автономность анаэробиза. Устройство обеспечивает максимальное сокращение времени контакта бакматериала с кислородом воздуха, упрощение методологии процесса при высокой высеваемости анаэробных микроорганизмов. 1 ил.

Устройство для автономного анаэробиоза микроорганизмов разового использования, включающее герметичный контейнер с химическим генератором СО₂, отличающееся тем, что герметичный контейнер выполнен в виде двухкамерного цилиндра с образованием верхней и нижней камер, снабженного разновеликими патрубками с герметизирующими колпачками на них, при этом нижняя камера сообщена с указанными патрубками и предназначена для размещения бакматериала и питательной среды, а верхняя камера на две трети объема снизу заполнена химическим генератором СО₂ с ограничительными прокладками, причем оставшаяся часть объема этой камеры сообщена с одним из патрубком посредством технологического окна для поступления водяных паров к химическому генератору.