ШТАММ ГРИБА ASPERGILLUS ORYZAE - ПРОДУЦЕНТ КИСЛЫХ И СЛАБОКИСЛЫХ ПРОТЕАЗ Российский патент 2008 года по МПК C12N1/14 C12N9/62 C12R1/69 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к созданию нового штамма Aspergillus oryzae 107 - продуцента кислых протеаз с высокой общей и удельной активностью в культуральной жидкости. Штамм получен селекцией из известного штамма Aspergillus oryzae 387 (ВКПМ F-683) путем многоступенчатой селекции с использованием эффективных методов мутагенеза. Изобретение обеспечивает высокий уровень синтеза кислых протеаз при сокращении длительности культивирования.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к созданию нового штамма, используемого для получения фермента, - комплекса кислых и слабокислых протеаз. Протеолитические ферменты широко применяются в различных отраслях промышленности: спиртовой, мясомолочной, пивоваренной, винодельческой, сельскохозяйственной и других. Это обусловлено тем, что перерабатываемое сельскохозяйственное сырье содержит высокомолекулярные белковые полимеры. Наиболее характерное практическое применение комплексных препаратов кислых и слабокислых протеаз связано с интенсификацией биотехнологических процессов в бродильных отраслях при производстве спирта, пива, мясомолочной промышленности, сыроделии и т.д. Кислые протеазы применяются также для протеолиза микробного белка с целью получения биологически активных пищевых и кормовых добавок. Протеолитические ферменты получают как продукт биосинтетической деятельности грибов или бактерий (1, 2). Однако использование грибов более предпочтительно, чем бактерий, так как они синтезируют сложный комплекс протеаз, в состав которого входят активные пептидазы и протеиназы, осуществляющие более эффективный катализ белковых полимеров в кислой зоне рН. В связи с этим селекция новых грибных штаммов для получения кислых протеаз актуальна.

Известны штаммы - продуценты грибных протеаз из рода Aspergillus oryzae 251-90, 824-32 (3, 4), при глубинном культивировании которых синтезируются кислые и слабокислые протеазы. Недостатком этих продуцентов является их низкая продуктивность, сложный состав питательных сред, а также длительный период роста продуцентов.

Наиболее близким к заявляемому объекту является штамм Aspergillus oryzae 387, регистрационный номер ВКПМ F-683 (2), один из наиболее активных продуцентов протеаз. В глубинной культуре известного штамма Asp. Oryzae 387 на 42 часа роста протеолитическая активность достигает 11,5 ед. ПС/см³ в зависимости от состава питательной среды.

Недостатком этого штамма является низкий уровень протеолитической активности культуральной жидкости (к.ж.), особенно в кислой области рН (2,5-4,0).

Задачей, поставленной настоящим изобретением, является получение штамма гриба Aspergillus oryzae, обладающего высокой способностью к образованию комплекса протеаз, проявляющих максимальную активность в кислой и слабокислой зоне рН.

Технический результат, получаемый от использования нового штамма Aspergillus oryzae 107, заключается в получении кислых и слабокислых протеаз с высокой общей активностью в культуральной жидкости, превышающей аналог в 2,0-2,6 раза, при сокращении длительности процесса культивирования.

Задача решается созданием нового штамма путем селекции и мутагенеза из известного штамма Aspergillus oryzae 387 (5), способного к быстрому росту на простых по составу питательных средах.

Заявляемый штамм Aspergillus oryzae 107 получен путем многоступенчатой селекции с использованием эффективных методов мутагенеза, депонирован в ВКПМ под №F-929.

В результате мутагенеза после неоднократного отбора и рассева вариантов был получен штамм Aspergillus oryzae 107 - продуцент кислых и слабокислых протеаз, обладающий высокой скоростью роста и продуктивностью комплекса кислых и слабокислых протеаз.

Изучали уровни продукции кислых и слабокислых протеаз в культуральной жидкости, полученной путем выращивания заявляемого штамма и известных штаммов в жидкой питательной среде с аэрацией и перемешиванием. Общую протеолитическую активность определяли модифицированным методом Ансона с использованием в качестве субстрата бычьего гемоглобина при различных значениях рН и оптимальной температуре действия протеаз. Сравнительные показатели уровней протеолитических активностей культуральной жидкости штамма Asp.oryzae 107 с прототипами представлены в табл.1.

Таким образом, в результате селекции и мутагенеза получен новый штамм Aspergillus oryzae 107, обладающий высоким уровнем синтеза протеаз и сокращенной длительностью процесса культивирования, что позволяет повысить технологичность процесса получения ферментов кислых и слабокислых протеаз при использовании штамма Aspergillus oryzae 107. Штамм отличается от известного и по культурально-морфологическим признакам.

Штамм хранится в виде лиофильно высушенной культуры и на косяках с суслом-агаром, в отделе биотехнологии ферментных препаратов в пищевой промышленности государственного научного учреждения ВНИИ пищевой биотехнологии г. Москвы.

Штамм Aspergillus oryzae 107 характеризуется следующими свойствами.

Культуральные признаки. Через 6 суток роста на сусле-агаре образуются колонии диаметром 50-53 мм, поверхность колонии шероховатая с концентрическими окружностями, профиль колонии плоский, форма колонии неправильная, края волнистые, цвет - зеленый, края светло-желтые, с возрастом цвет колонии темнеет. Цвет с обратной стороны - серый.

При росте на агаризованной среде Чапека размер колонии через 6 суток 30-32 мм, цвет колонии коричнево-зеленый, форма колоний округлая, края ровные.

На всех средах наблюдается обильное спорообразование, пигменты в среду не выделяются, эксудата нет, слабый запах плесени.

Морфология штамма. Мицелий гриба септированный, разветвленный, со вздутиями, конидии формируются экзогенно; поверхность конидий гладкая, форма, в основном, округлая; толщина гиф 4-6 мкм.

Физиолого-биохимическая характеристика. Тип катаболизма - дыхание. Отношение к кислороду - аэроб. Оптимальная температура роста 30-32°С, максимальная - 50°С, минимальная - 18°С. Оптимальное значение рН среды для роста гриба и биосинтеза ферментов 5,4; рост продуцента имеет место в зоне рН от 2,5 до 10,0.

В качестве источника углерода гриб использует крахмал, глюкозу, сахарозу, ксилозу, мальтозу, маннит, глицерин, галактозу. Продуцент ассимилирует нитраты, аммонийный и аминный азот, белки.

Штамм непатогенный.

Штамм Aspergillus oryzae 107 использовали для получения кислых и слабокислых протеаз.

Изобретение характеризуется следующими примерами.

Пример 1. Штамм Aspergillus oryzae 107 культивируют на питательной среде следующего состава, %: ячменная мука - 3,0; пшеничные отруби - 3,0; КН₂PO₄ - 1,5; остальное - водопроводная вода, рН - естественный. Ферментационную питательную среду засевают вегетативным посевным материалом в количестве 4%, выращенным при 30°С в течение 18 часов. Культивирование гриба осуществляют в колбах Эрленмейера объемом 750 см³, содержащих 50 см³, на круговой качалке (220-240 об/мин) при температуре 30-32°С в течение 38 часов. Активность внеклеточных протеаз составляет: при рН 2,5 - 3,6 ед. ПС/см³; при рН 4,0 - 12,6 ед. ПС/см³; при рН 4,5 - 18,0 ед. ПС/см³; при рН 5,5 - 18,5 ед. ПС/см³.

Пример №2. Штамм Aspergillus oryzae 107 культивируют на питательной среде следующего состава, %: ячменная мука - 3,0; пшеничные отруби - 3,0; КН₂РО₄ - 1,5; остальное - водопроводная вода, рН - естественный. Ферментационную питательную среду засевают вегетативным посевным материалом в количестве 4%, выращенным при 30°С в течение 18 часов. Культивирование гриба осуществляют в колбах Эрленмейера объемом 750 см³, содержащих 50 см³, на круговой качалке (220-240 об/мин) при температуре 28°С в течение 40 часов. Активность внеклеточных протеаз составляет 19,9 ед. ПС/см³.

Пример №3. Штамм Aspergillus oryzae 107 культивируют на питательной среде следующего состава, %: ячменная мука - 3,0; пшеничные отруби - 3,0; КН₂РО₄ - 1,5; остальное - водопроводная вода, рН - естественный. Ферментационную питательную среду засевают вегетативным посевным материалом в количестве 4%, выращенным при 30°С в течение 18 часов. Культивирование гриба осуществляют в колбах Эрленмейера объемом 750 см³, содержащих 50 см³, на круговой качалке (220-240 об/мин) при температуре 30°С в течение 40 часов. Активность внеклеточных протеаз составляет 20,8 ед. ПС/см³.

Пример №4. Штамм Aspergillus oryzae 107 культивируют на питательной среде следующего состава, %: ячменная мука - 3,0; пшеничные отруби - 3,0; КН₂РО₄ - 1,5; остальное - водопроводная вода, рН - естественный. Ферментационную питательную среду засевают вегетативным посевным материалом в количестве 4%, выращенным при 30°С в течение 18 часов. Культивирование гриба осуществляют в колбах Эрленмейера объемом 750 см³, содержащих 50 см³, на круговой качалке (220-240 об/мин) при температуре 32°С в течение 40 часов. Активность внеклеточных протеаз составляет 21,5 ед. ПС/см³.

Пример №5. Штамм Aspergillus oryzae 107 культивируют на питательной среде следующего состава, %: ячменная мука - 3,0; пшеничные отруби - 3,0; КН₂РО₄ - 1,5; остальное - водопроводная вода, рН - естественный. Ферментационную питательную среду засевают вегетативным посевным материалом в количестве 4%, выращенным при 30°С в течение 18 часов. Культивирование гриба осуществляют в колбах Эрленмейера объемом 750 см³, содержащих 50 см³, на круговой качалке (220-240 об/мин) при температуре 34°С в течение 40 часов. Активность внеклеточных протеаз составляет 20,5 ед. ПС/см³.

Таблица 1Сравнительная оценка физиологической активности грибов Aspergillus oryzae - продуцентов протеазШтаммДлительность культивирования, чПротеолитическая активность, ед. ПС/см³рН 2,5рН 4,0рН 4,5рН 5,5251-90720,63,95,75,9387422,06,911,011,5107384,118,023,022,5Таблица 2Влияние температуры роста на протеолитическую активность гриба Aspergillus oryzae шт.387 и шт.107ШтаммДлительность роста, чПротеолитическая активность, ед. ПС/см³28°С30°С32°С34°С36°С38740
488,9
10,510,1
11,98,5
9,26,0
5,34,2
3,110740
4819,9
21,020,8
21,324,8
23,920,5
19,517,5
12,0

Источники литературы

1. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. - М.: Изд. "Элеватор". 2000.

2. Патент РФ 2208633, кл. 12 N 1/20, 2001.

3. Зуева Р.В. Физиолого-биохимические исследования экспериментально полученного мутанта Aspergillus oryzae - активного продуцента кислой протеиназы. Автореферат канд. диссертации. - М.: 1971.

4. А.с. СССР №1440922, кл. С12N 1/14, 1988.

5. Патент РФ 2070921, кл. 12 N 1/14, 1993.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к созданию нового штамма, используемого для получения фермента - комплекса кислых и слабокислых протеаз. Штамм получен селекцией из известного штамма Aspergillus oryzae 387 (ВКПМ F-683) путем многоступенчатой селекции с использованием эффективных методов мутагенеза. Штамм хранится в виде лиофильно высушенной культуры и на косяках с суслом-агаром в отделе биотехнологии ферментных препаратов в пищевой промышленности государственного научного учреждения ВНИИ пищевой биотехнологии г. Москвы. Изобретение обеспечивает получение штамма, обладающего высоким уровнем синтеза кислых и слабокислых протеаз с высокой общей активностью в культуральной жидкости, превышающей аналог в 2,0-2,6 раза, при сокращении длительности процесса культивирования. 2 табл.

Штамм гриба Aspergillus oryzae 107, ВКПМ F-929 - продуцент кислых и слабокислых протеаз.