Способ получения кормового L-лизина Советский патент 1990 года по МПК C12P13/08 

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения кормового L-лизина биосинтезом из крахмалсодержащего сырья.

Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта.

Способ осуществляют следующим образом,

Крахмалсодержащее сырье (некондиционное пшеничное, ржаное, овсяное, кукурузное, зерно-картофельное сырье) разваривают и подвергают ферментатив

ному гидролизу действием культуры или смеси культур - продуцентов гидролитических ферментов, находящихся в физиологически активном состоянии в конце экспоненциальной или начале стаци- онарной фаз. Гидролиз ведут до содержания в среде усвояемых углеводов 3- 7%. Температуру поддерживают в пре- - делах 55-65°С, продолжительность гид- релиза 1-2 ч. В этих условиях, наряду с гидролизом крахмалсодержащего сырья происходит частичное разрушение клето культур - продуцентов ферментов и выделение в среду продуктов их метабо- лизма. Это обогащает среду биологически активными веществами, при этом гидролитические ферменты сохраняют свою активность. Затем полученную среду охлаждают до 29-30 С, оптимальной для биосинтеза L-лизина, вводят в нее минеральные соли и фактор роста и засевают продуцентом L-лизина. В качестве продуцента лизина используют штаммы Brevibacterium 22 L или Brevibac- terium E-531. Биосинтез L-лизина ведут в оптимальных условиях. Одновременно с биосинтезом лизина происходит ферментативный гидролиз крахмалсодержащего сырья, поскольку в среде содержатся хотя и в ослабленном виде продуценты гидролитических ферментов, т.е. имеет место,совместное культивирование культур - продуцентов ферментов и культуры - продуцента лизина.

Ослабленные культуры - продуценты ферментов не угнетают жизнедеятельность продуцента лизина.

Используют продуценты гидролитических ферментов широкого спектра действия, что позволяет более полно и эф- фективно использовать все составные части сырья. Под действием амилаз осуществляется гидролиз крахмала; под действием протеаз гидролизуются растительные белки, содержащиеся ъ сырье и происходит обогащение среды легкоусвояемым аминным азотом; под действием целлюлаз гидролизуются некрахмальные полисахариды, образуя усвояемые углеводы. Совместное применение продуцентов указанных ферментов способствует увеличению выхода L-лизина.

Для улучшения аэродинамических свойств среды для биосинтеза лизина к ней добавляют 2-4% мелассы.

Пример 1. Для производства L-лизина в лабораторных условиях ис- пользуют измельченное некондицион0

5

D ,

35

4045 §0

ное пшеничное сырье в соотношении с водой, равном 1:4. Пшеничный замес разваривают при давлении 0,15 МПа в течение 1,5ч охлаждают до 65°С и стерильно задают культуральную жидкость Bacillus subtilis-82, содержащую L-амилазу в количестве 0,3%. Предварительно культуру В.subtilis- 82 выращивают в колбах Эрленмейера- объемом 750 мл на среде, содержащей %: кукурузная муке 9,0: кукурузный экстракт 2,5 ( 0,6; мочевина 0,4; мел 0,2, до достижения конца экспоненциальной фазы роста, что соответствует 32 ч от начала культивирования. Таким образом, культуру - продуцент L-амилазы задают в физиологически активном состоянии. Уровень активности L-амилазы 50 ед. АС/мл культуральной жидкости. Первую стадию ферментативного гидролиза осуществляют в анаэробных условиях при периодическом перемешивании в течение 2 ч при 60°С до содержания редуцирующих углеводов 2%. Расход амила- ЗБ1 1,3 ед. АС/г крахмала. Наряду с гидролизом крахмала происходит частичное разрушение клеточной структуры продуцентов ферментов и выделение продуктов метаболизма в среду. На этой же стадии в среду стерильно задают подготовленные растворы ростовых веществ и солей, %: кукурузный экстракт 4,6; сульфат аммония 3,0; фосфат калия 0,1; сульфат магния 0,05; мел 2,0, рН среды доводят до 7,2.

Затем температуру снижают до 30°С и стерильно засевают Brevibacterium 22 L - продуцент L-лизина в количестве 6%, осуществляя культивирование микроорганизмов в аэробных условиях в колбах Эрленмейера объемом 750 мл одновременно с продолжающимся гидролизом крахмала.

Процесс биосинтеза лизина длится 66 ч. Выход лизина 20,0 г/л.

Пример 2. Подготовку источника углерода проводят аналогично примеру 1. Разваренное пшеничное сырье (сусло) охлаждают до 65СС и ведут ферментативный гидролиз, добавляя источник L -амилазы по примеру 1 в количестве 0,6% или 2,5 ед. АС/г крахмала сырья. Длительность ферментативного гидролиза составляет 1 ч, количество редуцирующих углеводов 3,0%. Далее процесс осуществляют аналогич51576566

но примеру 1. Длительность культивирования Brevibacterium 22 L составляет 65 ч. Содержание лизина в культу- ральной жидкости 27,0 г/л.

д и н 3

П р и м е р 3. Подготовку источника углерода ведут аналогично примеру 1. Разваренное пшеничное сусло охлаждают до и- ведут ферментативный гидролиз, добавляя источник L-амилазы по примеру 1 в количестве 1,3 ед. АС/г крахмала сырья, а в ка- честве источника глюкоамилазы дополнительно вводят культуру Aspergillus awamori BYD в количестве 0,35%. Предварительно культуру Asp. awaraori ВУО выращивают на среде, содержащей осаха- реиное кукурузное сусло, до начала стаци онарной фазы роста, что соответствует 96 ч от начала культивирования. Физиологически активная культуральная жидкость содержит фермент глюкоамила- зу в количестве 150 ед. ГлС/мл. Расход глюкоамилазы составляет 3,0 ед. ГлС/г крахмала. Ферментативный гидролиз ведут до содержания редуцирующих углеводов 3,8%. Далее процесс осуществляют так же, как в примере 1. Длительность культивирования Brevibacterium 22 L составляет 65 ч. Выход лизина 31,5 г/л.

П р и м е р 4. Процесс биосинтеза L-лизина ведут аналогично примеру 1, только в качестве источника углеводов используют некондиционное ржаное сырье, а в качестве продуцента лизина - культуру Brevibacterium E-531. Длительность культивирования 68ч, выход лизина 32,2 г/л.

Пример5. В качестве источника углевсдов используют некондиционное ржаное сырье, подготовку которого осуществляют аналогично примеру 4. В качестве источника ростового фактора вместо кукурузного экстракта используют БВК в количестве 2%.

Ферментолизат БВК готовят путем длительного протеолиза кормовых дрожжей комплексным ферментным препаратом Протооризином Гх (КФП), содержащим 15 ед. ПС/мл. КПФ дозируют из расчета 5 ед. на 1 г БВК. Протеолиз осуществ10

15

20

Процесс подготовки питательной сре ды для засева Brevibacterium E-531 и культивирования проводят аналогично примеру 4. Длительность ферментации составляет 66 ч. Выход лизина 36,8 г/л.

П р и м е р,6. В качестве основног источника углеводов используют не- х кондиционное ржаное сырье. Подготовка и состав питательной среды аналогичны примеру 5. При проведении ферментативного гидролиза в качестве источника протеаз используют культуру Asp. oryzae 251-90, находящуюся в физиологически активном состоянии и содержащую, наряду с протеолитичес- кими, амилолитические ферменты. Источ ником глюкоамилазы служит культура Asp. awamori. BYD, вводимая в процесс аналогично примеру 3. Культуру Asp. oryzae 251-90,продуцент протеаз и L-амилазы предварительно выращивают на среде, содержащей, %: ячменная му- 25 ка 4,0; соевая мука 1,0, однозамещен- ный фосфат калия 1,5, до начала стационарной фазы роста, что соответствует 36 ч от начала культивирования. В физиологически активной культуре Asp. oryzae 251-90 содержится 10 ед. АС и 11 ед. ПС/мл культуральной жидкости. Культуру задают в количестве 1,2%, что соответствует 1,2 ед. АС/г крахмала сырья и 4,0 ед. ПС/г белка.

Далее процесс осуществляется так 35 же, как в примере 5. Длительность фер мент.ации 66 ч, выход лизина 38,4 г/л.

Пример 7. В качестве источника углеводов используют некондицион- ное овсяное сырье.. Подготовка и состав питательной среды аналогичны примеру 5. При проведении ферментативного гидролиза в качестве источника целлюлолитических ферментов вводят дополнительную культуру Geotrichum 45 candidum Зс в количестве 2,0%. Источником глюкоамилазы служит культура Asp. awamori BYD, L-амилазы - ВАС. subtilis-82, вводимые в процесс аналогично примеру 3. Ферментативный гид ролиз компонентов сырья проводят при 65 С в течение 1,5 ч до содержания редуцирующих углеводов 5%.

30

40

50

ляют при рН 4,7, температуре 55 С, Предварительную культуру Geotricсоздавая оптимальные условия для дей- «lium candidum Зс выращивают на среде,

ствия протеаз, в течение 2 ч при пери-содержащей, %: пшеничные отруби 2,0;

одическом перемешивании, затем темпе-свекловичный жом 2,0; однозамещенный ратуру снижают до 30е С и выдерживают в течение 16 ч.

фосфат калия 0,1; сульфат аммония 0,15; сульфат магния 0,05; нитрат нат

5

Процесс подготовки питательной среды для засева Brevibacterium E-531 и культивирования проводят аналогично примеру 4. Длительность ферментации составляет 66 ч. Выход лизина 36,8 г/л.

П р и м е р,6. В качестве основного источника углеводов используют не- х кондиционное ржаное сырье. Подготовка и состав питательной среды аналогичны примеру 5. При проведении ферментативного гидролиза в качестве источника протеаз используют культуру Asp. oryzae 251-90, находящуюся в физиологически активном состоянии и содержащую, наряду с протеолитичес- кими, амилолитические ферменты. Источником глюкоамилазы служит культура Asp. awamori. BYD, вводимая в процесс аналогично примеру 3. Культуру Asp. oryzae 251-90,продуцент протеаз и L-амилазы предварительно выращивают на среде, содержащей, %: ячменная му- 5 ка 4,0; соевая мука 1,0, однозамещен- ный фосфат калия 1,5, до начала стационарной фазы роста, что соответствует 36 ч от начала культивирования. В физиологически активной культуре Asp. oryzae 251-90 содержится 10 ед. АС и 11 ед. ПС/мл культуральной жидкости. Культуру задают в количестве 1,2%, что соответствует 1,2 ед. АС/г крахмала сырья и 4,0 ед. ПС/г белка.

Далее процесс осуществляется так 5 же, как в примере 5. Длительность фер- мент.ации 66 ч, выход лизина 38,4 г/л.

Пример 7. В качестве источника углеводов используют некондицион- - ное овсяное сырье.. Подготовка и состав питательной среды аналогичны примеру 5. При проведении ферментативного гидролиза в качестве источника целлюлолитических ферментов вводят дополнительную культуру Geotrichum 5 candidum Зс в количестве 2,0%. Источником глюкоамилазы служит культура Asp. awamori BYD, L-амилазы - ВАС. subtilis-82, вводимые в процесс аналогично примеру 3. Ферментативный гидролиз компонентов сырья проводят при 65 С в течение 1,5 ч до содержания редуцирующих углеводов 5%.

0

0

0

свекловичный жом 2,0; однозамещенный

фосфат калия 0,1; сульфат аммония 0,15; сульфат магния 0,05; нитрат натрия 0,15, до начала стационарной фазы роста, что соответствует 50 ч от начала культивирования.

В культуральной жидкости Geotri- chum candidum 3с содержится 1,0 ед. 5ХВ/мл (ОХВ - активность ферментов, осахаривающих хлопковое волокно).

Далее процесс осуществляют так же как в примере 6. Длительность ферментации 68 ч, выход лизина 39,9 г/л. Введение целлюлолитичёсЧсих ферментов целесообразно при использовании пленчатых i зерновых культур, содержащих большое количество некрахмальных полисахаридов.

Примерв. Процесс биосинтеза лизина ведут аналогично примеру 5, но на овсяном сырье и в среду перед посевом продуцента лизина в питательную среду добавляют стерильный раство мелассы в количестве 2%. Длительност ферментации 68 ч, выход лизина 41,2 г/л.

П р и м е р 9. Процесс ведут аналогично примеру 5, но перед посевом культуры - продуцента лизина в питательную среду добавляют стерильный раствор мелассы в количестве 3%. Длительность ферментации 66 ч, выход лизина 41,9 г/л.

П р и м е р Ю. Процесс ведут аналогично примеру 5, но перед посевом культуры - продуцента лизина в питательную среду добавляют стерильный раствор мелассы в количестве 4%. Длительность культивирования 66 ч, выход лизина 42,1 г/л.

Формула изобретения

4 1. Способ получения кормового L- лизина, включающий ферментативный гидролиз крахмалсодержащего сырья действием культуры - продуцента гидро

0

5

0

5

0

литических ферментов, добавление к полученной среде минеральных солей и факторов роста, засев среды культурой - продуцентом лизина и проведение процесса биосинтеза лизина в оптимальных условиях, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, крахмал с оде ржущее сырье предварительно разваривают, для его гидролиза используют культуру или смесь культур - продуцентов ферментов в физиологически активном состоянии, процесс гидролиза ведут до содержания усвояемых углеводов в среде 3-7% при 55-65°С, осуществляя одновременно с гидролизом частичное разрушение клеток культуры - продуцента ферментов, затем полученную среду охлаждают до температуры, оптимальной для биосинтеза лизина, и процесс биосинтеза лизина ведут одновременно с гидролизом крахмалсодержащего сырья путем совместного культивирования клеток продуцента лизина и частично разрушенных клеток продуцентов ферментов.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что, с целью улучшения аэродинамических свойств среды для биосинтеза лизина, в нее добавляют мелассу в количестве 2-4%.

3.Способ по пп. 1-2, отличающийся тем, что в качестве продуцента лизина используют штаммы Brevibacterium 22 L или Brevibacteri- urn E-531.

4.Способ по пп. 1-3, отличающийся тем, что в качестве культуры - продуцента гидролитических ферментов используют штаммы Bacillus subtilis-82, Aspergillus awamori BYD, Aspergillus oryzae 251-90, Geotrichum « candidum Зс или их смеси.

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения кормового L-лизина биосинтезом из крахмалсодержащего сырья. Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта. Крахмалсодержащее сырье разваривают и гидролизуют действием культур микроорганизмов - продуктов гидролитических ферментов (Ф), взятых отдельно или в смеси, например BACILLUS SUBTILIS-82, ASPERGILLUS AWAMORI ВУД и др. Культуры - продуценты Ф - используют в физиологически активном состоянии - в конце экспоненциальной или начале стационарной фаз. Гидролиз крахмалсодержащего сырья ведут до содержания усвояемых углеводов в среде 3-7%. Температура гидролиза 55-65°С. При этом наряду с гидролизом сырья происходит частичное разрушение клеток продуцентов Ф и выделение в среду продуктов их метаболизма. Затем температуру среды снижают до значения, оптимального для биосинтеза лизина, добавляют минеральные соли и фактор роста, засевают среду культурой - продуцентом L-лизина, ведут одновременно оба процесса: биосинтез L-лизина и ферментативный гидролиз крахмалсодержащего сырья путем совместного культивирования продуцента лизина и гидролитических ферментов. В качестве продуцентов лизина используют штаммы BREVIBACTERIUM 22 L или BREVIBACTERIUM Е531. Для улучшения аэродинамических свойств среды для биосинтеза лизина в нее добавляют 2-4% мелассы. 3 з.п. ф-лы.