СПОСОБ ТРАНСФОРМАЦИИ ГЕНОМА ПТИЦЫ Российский патент 1994 года по МПК C12N15/89 

Изобретение относится к биологии и может быть использовано в генной инженерии при создании трансгенной птицы с важными в хозяйственном отношении признаками.

Известен способ трансформации генома путем микроинъекции, включающий вымывание овулировавшей яйцеклетки, микроинъекцию в нее гена и обеспечивающий получение трансгенных мышей. (Palmiter R. et al. Control of DNA seguence transcriotion - United States Patent (19) Patent N 4, 579. 821. Apr. 1. 1986).

Недостатком этого способа является то, что он разработан для мышей и непригоден для птицы.

Известен способ трансформации генома птицы путем микроинъекции чужеродной клонированной ДНК в яйцеклетку перед первыми делениями дробления с последующим культивированием эмбриона in vitro [1].

Недостатком такого способа является то, что данным способом после нескольких суток культивирования in vitro можно получать только эмбрионы, но он не позволяет получить живую трансгенную птицу.

Технический результат. Заявленный способ позволяет получить трансгенную птицу.

Сущность изобретения: микроинъекцию проводят в зародышевый диск яйцеклетки через стенку воронки яйцевода, при этом в области воронки яйцевода делают хирургический разрез через 25-35 мин после снесения яйца.

Способ осуществлялся следующим образом.

Эксперименты проводили на птице породы белый леггорн линии П6. Птицу выращивали в виварии при индивидуальном клеточном содержании и искусственном осеменении. У кур устанавливали циклы яйцекладки. Ежедневно учитывали время снесения яйца с точностью до 5 мин. Оперировали кур с ожидаемой овуляцией. У кур развит только левый яичник и соответственно левый яйцевод, поэтому хирургический разрез делали в боковой сагиттальной плоскости по брюшной стенке с левой стороны за бедром. Разрез в данном месте удобен тем, что он делается в области воронки яйцевода. Другие варианты разреза были менее удобны, так как ограничивались доступ к воронке яйцевода и возможность манипуляции с яйцеклеткой. Разрез в области воронки яйцевода открывает доступ к входной части яйцевода, не оказывает стрессирующего влияния на курицу и обеспечивает снесение яиц с нормальной скорлупой.

В предварительных вскрытиях было зафиксировано, что яйцеклетка у кур овулирует, как правило, через 25 мин после снесения предыдущего яйца, захватывается воронкой яйцевода и находится там в течение 5-10 мин. Стенка воронки яйцевода представляет собой прозрачную тонкую пленку, через которую виден зародышевый диск яйцеклетки. Через 35 мин после снесения яйца яйцеклетка продвигается дальше - в перешеек яйцевода - мускулистую, непрозрачную часть яйцевода. Поэтому представляется важным курицу не стрессировать раньше, чем через 25 мин после снесения яйца, за это время пройдет овуляция; через 25 мин курицу фиксируют на операционном столе, на правом боку, делают хирургический разрез, отодвигают мышечные ткани и открывают доступ к воронке яйцевода. На это уходит 5-7 мин. Затем, наблюдая яйцеклетку через прозрачную стенку воронки яйцевода, поворачивают осторожно яйцеклетку, находят зародышевый диск (светлое округлое пятно) яйцеклетки и проводят микроинъекцию по предлагаемому способу в зародышевый диск через тонкую прозрачную стенку воронки яйцевода, не извлекая яйцеклетки. Позже чем через 35 мин сделать микроинъекцию в зародышевый диск не представляется возможным, так как яйцеклетка находится уже в непрозрачной части яйцевода.

Зародышевый диск куриной яйцеклетки - это собственно область ядра яйцеклетки представляет собой округлую светлую область диаметром 3-4 мм. Его можно визуально обнаружить через прозрачную тонкую стенку воронки яйцевода. При поиске зародышевого диска яйцеклетки, находящейся в воронке яйцевода, пользовались дополнительным освещением от налобной лампы (с зеркальным отражателем).

В момент микроинъекции яйцеклетка находится на стадии метафаза 2 - анафаза 2.

Для микроинъекций использована генетическая конструкция, состоящая из гена гормона роста человека с металлотионеиновым промотором. ДНК поставлена ИМБ (Москва). Для эффективной экспрессии гена СТГ человека была создана рекомбинантная конструкция плазмиды рSMHG9, содержащая помимо клонированной комплементарной ДНК гена СТГ человека промоторную область гена металлотиониена мыши МТ1 (включающую энхансер, промотор и часть S-концевой нетранслируемой области мРНК), донорный и акцепторные участки сплайсинга из ранней области вируса SV40 и участок полиаденилирования РНК из этой же области.

Физическая карта плазмиды рSМНG9 дана в известной работе (Ениколопов Г. Н., Захарченко В.И., Гращук М.А. и др. Получение трансгенных кроликов, содержащих и экспрессирующих ген соматотропина человека. Доклады АН СССР, т. 299, N 5, 1988, с. 1246-1249).

При микроинъекциях иногда использовали налобные увеличительные очки (увеличение 2-5 раз). Микроинъекцию произ- водили стеклянной микропипеткой диаметром 2-4 мкм вручную без применения микроманипулятора в зародышевый диск яйцеклетки. Объем вводимого раствора ДНК в куриную яйцеклетку 100-200 пл.

Оперированных кур зашивали и сажали на свои места в клетки. Снесенные после операции яйца с нормальной скорлупой инкубировали. Развитие эмбрионов контролировали овоскопированием. Полученных цыплят выращивали в виварии. У подросших цыплят в возрасте 1,4-4 месяца после скармливания им в течение двух дней корма с добавкой сернокислого цинка (для активации промотора) брали кровь из крыловой вены для тестирования полученных по предлагаемому способу цыплят на наличие в их крови человеческого гормона роста.

При проведении экспериментов по трансформации генома птицы получены следующие результаты: после микроинъекции в 84 яйцеклетки по предлагаемому способу (через стенку воронки) было снесено 48 нормальных яиц. Из них получен 21 цыпленок, из которых четыре были трансгенными. Все особи были выращены и проанализированы. У одной трансгенной курицы N 5975 трансгенными были и ее потомки: три особи в первом поколении F₁ и пять особей во втором поколении F₂ .

Интеграцию введенного гена регистрировали блот-гибридизацией по Саузерну. Экспрессию инъецированного гена определяли по наличию гормона роста человека в крови кур методами иммуноферметного и радиоиммунологического анализа.

Результаты блот-гибридизационного анализа ДНК кур, полученных по предлагаемому способу, и их потомков представлены на чертеже, в таблице.

У пяти особей, полученных предлагаемым способом, иммуноферментным методом был зарегистрирован в крови гормон роста человека СТГч в концентрациях 0,5-2 нг/мл (в 2-3 раза выше фона) (таблица).

Наличие интегрированных последовательностей введенного гена самототропина человека выявлено (чертеж, таблица); у курицы 5975 - во всех исследованных тканях: в тонком кишечнике, в толстом кишечнике, в легких, желудке, печени, яичнике, яйцеводе, сердце, гребне.

У этой курицы наблюдали также экстерьерные особенности: удлиненное туловище, резкое оперение без пуха в возрасте до четырех месяцев;
у курицы 1581 - в печени, мышечной ткани (пробы N 374, 375, 376);
у курицы 2314 - в сердце, мышечной ткани (пробы N 512, 513);
у петуха 1560 - в мышечной ткани (проба N 696).

От трансгенных кур 5975 и 1581 было отведено потомство (чертеж). В первом поколении от 5975 было выращено 23 особи, из них у пяти была зарегистрирована экспрессия гена (наличие СТГч в крови) и у трех интеграция гена:
у курицы 1591 - в мышечной ткани, гребне, легких (пробы N 650, 651, 652);
у курицы 3905 - в гребне, печени, в сердечной мышце (пробы N 275, 272, 274);
у петуха 2608 - в сперме (проба N 173).

Во втором поколении F₂ курицы 5975 было выращено: от курицы 1591 - 20 особей и от петуха - 29 особей.

Из 20 особей потомков 1591 у трех выявлено наличие СТГч в крови и у трех наличие интегрированного гена:
у петуха 3006 - в мышцах (проба N 851);
у курицы 0818 - в мышцах (проба N 637);
у петуха 0418 - в печени (проба N 691).

Из 29 особей потомства петуха 2608
у одного в крови найден СТГч и
у двух блот-гибридизацией зарегистрирована интеграция введенного гена:
у петуха 1518 - в гребне и мышцах (пробы N 630, 629, 376);
у курицы 2708 - в сердечной ткани и в печени (пробы N 432, 440).

В потомстве от курицы 1581 у одной особи в крови был найден гормон роста человека (таблица).

Полученные данные свидетельствуют о том, что наблюдается периодичность в экспрессии гена, так как наличие гормона роста человека в крови кур чередовалось с его отсутствием у одной и той же особи.

Представленный чертеж и обобщенный материал могут служить доказательством генетической трансформации генома птицы и передачи ее интегрированного гена по наследству.

Положительный эффект заявленного способа заключается в том, что при этом
исключается травмирование яйцеклетки и яйцевода, т.к. микроинъекции проводятся в яйцеклетки, естественным путем попавшие в воронку яйцевода;
исключаются извлечение яйцеклетки из половых путей и ее обратная трансплантация, т.к. микроинъекции проводятся через прозрачную тонкую стенку воронки яйцевода;
получили трансгенную птицу, несущую в своем геноме ген гормона роста человека (птица может быть использована для выделения из ее крови гормона роста человека).

Процент трансформации генома птицы составляет 19%.

Изобретение относится к биологии и может быть использовано в генной инженерии при создании трансгенной птицы с важным в хозяйственном отношении признаками. Микроинъекцию проводят в зародышевый диск яйцеклетки через стенку воронки яйцевода, при этом в области воронки яйцевода делают хирургический разрез через 25 - 35 мин после снесения яйца. При этом исключается травмирование яйцеклетки и яйцевода, т.к. микроинъекция проводится в яйцеклетки, естественным путем попавшие в воронку яйцевода, исключаются извлечение яйцеклетки из половых путей и ее обратная трансплантация, т.к. микроинъекция проводится через прозрачную тонкую стенку воронки яйцевода, получили трансгенную птицу, несущую в своем геноме ген гормона роста человека ( птица может быть использовано для выделения из ее крови гормона роста человека). Процент трансформации генома птицы составляет 19%. 1 ил., 1 табл.

СПОСОБ ТРАНСФОРМАЦИИ ГЕНОМА ПТИЦЫ, включающий микроинъекцию чужеродной ДНК, отличающийся тем, что микроинъекцию проводят в зародышевый диск яйцеклетки через стенку воронки яйцевода, при этом в области воронки яйцевода делают хирургический разрез через 25 - 35 мин после снесения яйца.