ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ПОЧКИ SUIS DOMESTICA L. ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСОВ ЖИВОТНЫХ Российский патент 1999 года по МПК C12N5/06 C12N7/00 A61K39/135 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается нового штамма культивируемых клеток свиной почки эмбриональной верс низированной (СПЭВ), который может быть использован для репродукции вирусов при вирусологических исследованиях и изготовлении антигенов для диагностики вирусных болезней животных.

Перевиваемые культуры клеток животных широко используются в вирусологии и биотехнологии. Их получают из различных органов и тканей животных с помощью различных методических приемов с использованием разнообразных питательных сред и растворов для культивирования, поддержания, пересевов и сохранения (1).

Культуры клеток общие и видовые характеристики. Большинство культур существенно отличаются по способности размножаться в питательных средах определенного состава, по пролиферативной активности, по чувствительности к вирусам, по физиологическим и цитогенетическим характеристикам, особенно при длительном пассировании в различных условиях культивирования, которые требуют тщательного контроля за основными характеристиками клеток. Даже клоны одной перевиваемой линии клеток значительно отличаются один от другого. Castro M.R. и Pysany R.S. получили различные по чувствительности к вирусу ящура клоны клеточной линии JB-RS-2 (2).

В лабораторной практике и в производстве биопрепаратов широко используются монослойные клеточные культуры.

Известно использование монослойных культур клеток ВНК-21, ПСГК-ЗО, JB-RS-2, щитовидной железы телят, СПЭВ, тестикулов поросят и т.д. для выращивания вирусов ящура, трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГС), классической чумы свиней (КЧС), болезни Ауески (БА), бешенства и многих других (3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11).

Однако технология монослойного культивирования клеток и вируса трудоемка, связана со значительным риском бактериального загрязнения и с большими материальными затратами.

Кроме того, большая часть монослойных перевиваемых клеточных линий состоит из неоднородных в морфологическом и физиологическом отношении клеток, что вызывает необходимость получения новых клеточных клонов, которые отличаются от материнской линии рядом положительных свойств и могут быть использованы для получения стабильных суспензионных клеточных линий.

В биотехнологии с каждым годом увеличивается число культур клеток, способных к размножению в суспензии, позволяющих готовить биомассу вирусов с меньшими экономическими затратами и в больших количествах.

Известен ряд суспензионных культур клеток, полученных из монослойных культур клеток почек свиней.

Известен штамм культивируемых клеток почки свиньи JB-RS-2, адаптированный к суспензионному культивированию (12).

Недостаток данной культуры клеток состоит в том, что она исходно контаминирована аттенуированным вирусом КЧС, так как получена из ткани поросенка, иммунизированного живой вакциной, что практически исключает возможность ее применения для диагностики и производства живых противовирусных препаратов для этого вида животных. Кроме того, последнее упоминание об этой культуре относится к 1976 году. Она, по-видимому, утеряна.

Известен также штамм культивируемых клеток почки эмбриона свиньи ППК-666, отличающийся от материнской первичной линии набором хромосом и способностью размножаться в суспензии на полусинтетических средах (13).

Основной недостаток данной культуры клеток состоит в том, что она также исходно контаминирована аттенуированным вирусом КЧС. Кроме того, технология культивирования указанных клеток в суспензии имеет ряд недостатков, при этом существенными из них являются следующие:
- сыворотка свиней не может быть рекомендована для производства вакцин против ВБС и других болезней свиней с везикулярным синдромом ввиду возможного содержания антител, ингибирующих репродукцию упомянутых вирусов;
- агрегация клеток в конгломератах до 50 и более затрудняет их подсчет и ведет к снижению адсорбции вируса на клетку, а затем его репликацию;
- процесс ревилитации клеток ППК-666 замедлен, восстановление исходных свойств клеток после реконсервирования происходит на 2-3 пассаже культивирования;
- аэрация при суспензионном культивировании на питательной среде с солевой основой Эрла требует обязательного присутствия ионов С0₂. Для этого требуется постоянный источник его получения, кроме того, углекислый газ может содержать примеси, тормозящие метаболизм клеток.

Известен также штамм культивируемых клеток ПКПС, полученный из первичной культуры ткани почек свиньи (14).

Недостатки этой культуры состоят в ее высокой себестоимости, так как она растет в суспензии на среде, включающей 0,25% гидролизата мышечного ферментативного сухого (ФГМ-С).

Известен также штамм культивируемых клеток ПСГК-60, обладающий высокой чувствительностью к большому числу вирусов различных таксономических групп, в том числе к ящуру, ВБС, ВС, КЛО, КЧС, БА (15).

Недостатки этой культуры состоят в том, что штамм клеток ПСГК-60 получен селекцией клеток ПСГК-30, отнесенных к клеткам свиного происхождения, что может быть результатом контаминации и показателем смешанной культуры. Кроме того, выращивание данной культуры отличается также высокой себестоимостью, так как для этого используют среды с 0,25% ФГМ-С с добавлением 10% сыворотки крови КРС (16).

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является штамм культивируемых клеток СПЭВ (17, 18, 19).

Во ВНИИ зашиты животных монослойный трофовариант культуры клеток СПЭВ поступил в 1987г. из Болгарии без паспортных данных. При паспортизации в течение 5 пассажей в монослое клеток СПЭВ-Болгария были установлены следующие характеристики.

1. Способ поддержания. Выращивают в монослое при 37^oC на среде Игла с 10% сывороткой крови КРС. Для диспергирования клеточного пласта при очередном пассаже используют смесь 0,02% версена и 0,25% трипсина.

2. Ростовые свойства. При пересеве с кратностью 1:3 монослой формируется на 3 сутки и сохраняется в течение 5 суток. Индекс пролиферации 1:1 -1:1,5.

3. Морфология. Клетки эпителиофибробластоподобного типа.

4. Кариология. По изоферментам ЛДГ, Г-6ФДГ и по кариотипу соответствовали клеткам домашней свиньи.

5. Среда замораживания. 5% этиленгликоля с 10% сыворотки крови КРС позволяет сохранить 93- 97% клеток после хранения при -196^oC. Восстановление ростовой активности наступает на 3 пассаже после разморозки.

Данная линия клеток имеет ряд недостатков, из которых существенными являются:
1. Низкая пролиферативная активность (1:2), обусловливающая необходимость большого расхода диспергирующего раствора и времени получения необходимого количества клеточной массы.

2. Высокая опасность контаминирования клеток при диспергировании.

3. Длительность процесса ревитализации после хранения в жидком азоте при -196^oC.

4. Строго опорозависимый характер роста клеток исключает возможность их крупномасштабного культивирования в суспензии.

5. Низкая активность вирусного материала, выращенного в данной культуре клеток.

В задачу создания настоящего изобретения входило получение нового штамма культивируемых клеток СПЭВ, растущего в монослое и в суспензии и обладающего более высокой пролиферативной активностью, более длительной сохраняемостью клеточного пласта, что позволяет получать большое количество клеточной массы и вируссодержащего культурального материала с высокой инфекционной активностью.

Технический результат от использования изобретения заключается в повышении урожайности клеточной массы и вируссодержащего культурального материала с высокой инфекционной активностью.

Указанный технический результат достигнут получением нового штамма культивируемых клеток свиной почки эмбриональной версенизированной (Suis domestica L) СПЭВ-17/91, который предназначен для выращивания вирусов животных. Полученный штамм хранится в музее клеток ВНИИЗЖ и депонирован на уровне 35 пассажа в суспензии в ВСКК(СХЖ) РАСХН под N 43.

Характеристика штамма СПЭВ-17/91
Родословная штамма
Монослойный трофовариант культуры клеток СПЭВ поступил в 1987 году из Болгарии. Поступившие клетки на 1 пассаже были обработаны супермутагенами диметилсульфатом и ультрафиолетовыми лучами в аппарате" Изольда", а затем клетки клонировали методом предельных разведений на питательных средах в монослое и суспензии. В результате получен штамм СПЭВ-17/91.

2. Число пассажей к моменту паспортизации
Штамм имеет 105 пассажей в монослое и 35 пассажей в суспензии.

3. Стандартные условия выращивания
Штамм клеток выращивают при 37-38^oC в пристеночных условиях в сосудах различной емкости в среде Игла с 10% сыворотки КРС и 0,03% глутамина; в суспензии - в модифицированной среде Игла без солей кальция с пируватом натрия, 10% сыворотки КРС и 0,03% глутамина. Штамм адаптирован к средам с гидролизатом белков животного происхождения, с сывороткой крови КРС или лошади.

4. Культуральные свойства
Клетки формируют полный плотный монослой, обладающий ориентированным ростом и образующий характерный рисунок на субстрате. Дезагрегацию клеток осуществляют с помощью смеси трипсин-версен (1: 3) с добавлением 0,5% декстрозы. В зависимости от кратности рассева (1:3 - 1:4), от посевной дозы (70-100 тыс/мл) субкультивирование составляет 2-3 суток.

5. Ростовые (кинетические) характеристики в монослое
При посевной концентрации 70-100 тыс./мл монослой формируется на 2-3 сутки без смены среды.

6. Ростовые (кинетические) характеристики в суспензии
При посевной концентрации 500 тыс/мл индекс пролиферации через 48 часов культивирования составляет 3,6 - 4,6.

7. Цитоморфологические характеристики
Монослой ровный, рост ориентированный, клетки эпителиоподобного типа полигонального вида. Ядра округлой или овальной формы различной величины, число ядрышек 1 - 3. Соотношение площади ядра к площади клетки составляет 1: 5 - 1:6.

Суспензия клеток однородна. Клетки располагаются дискретно, иногда образуют группы по 2-3 клетки.

8. Кариологическая характеристика штамма
Кариотип соответствует видовому признаку свиньи. Модальный класс 2n=38, из них клеток с диплоидным набором хромосом - 12%, гипоплоидных - 20% и гиперплоидных - 68%.

9. Маркерные признаки и методы их оценки
Маркерные признаки не выявлены. Штамм по цитокариологии и спектру изоферментов (лактатдегидрогеназа-ЛДГ, глюкоза-6- фосфатдегидрогеназа-Г6ФДГ) относится к виду свиньи.

10. Данные о видовой принадлежности
Кариотип и изоферменты ЛДГ и Г6ФДГ соответствуют виду свиньи. Штамм обладает высокой устойчивостью и сохраняет видовую принадлежность в процессе 105 последовательных пассажей в монослое и 35 - в суспензии, при замораживании, хранении при -196^oC и ревилитации.

11. Характеристика контаминированности
Контаминанты не выявлены (высевы на МПА, МПБ, ТГС, среду Сабуро, 0,3% PPLO-агар).

12. Биотехнологические характеристики
В монослое клетки выращивают при 37-38^oC в среде Игла pH 7,0-7,2 с 10% сыворотки КРС и 0,03% глутамина, кратность пересева 1:3 - 1:4, посевная концентрация 70 - 100 тыс./мл, образование монослоя к 48-72 часам инкубирования без смены среды. Клетки снимают со стекла подогретой до 37^oC смесью трипсин-версен (1:3) с 0,5% декстрозы.

В суспензии клетки выращивают в среде Игла без солей кальция с перуватом натрия, 10% сыворотки КРС и 0,03% глутамина при посевной концентрации 500 тыс/мл, индекс пролиферации 3,6-4,6 к 72 часам культивирования в сосудах при подаче воздуха. При отсутствии среды Игла клетки СПЭВ-17/91 могут быть успешно адаптированы методом последовательных пассажей к питательным средам, включающим гидролизаты белков крови, мышц и молока КРС с добавлением 10% сыворотки крови КРС и 0,3% глутамина.

Штамм обладает высокой устойчивостью и сохраняет видовую принадлежность в процессе 105 последовательных пассажей в монослое и 35 - в суспензии, при замораживании, хранении при -196^oC и ревилитации. Жизнеспособность штамма определяют суправитальным окрашиванием трипановым синим и посевом в культуральные сосуды.

Штамм обладает чувcтвительностью к вирусам различных таксономических групп, в том числе к вирусам: ящура A₂₂-663, O₁-194, C₁-564, Азия-1-48; болезни Гамборо (БГ), штамм "Ухтинский"; энтерита норок (ЭН), штамм "Родники"; БА штамм УНИИЭВ В-18, везикулярной экзантемы свиней (ВЭС), ВБС, чумы КРС и репродуцирует указанные вирусы при культивировании в монослое и в суспензии в титрах 5,0- 7,5 lg ТЦД₅₀/мл. Накопление вирусов определяют титрованием в высокочувствительных культурах клеток СП, ПСГК-3О и СПЭВ-17/91.

Результаты исследований по накоплению вирусов в монослое клеток СПЭВ-17/91 приведены в таблице 1.

Накопление инфекционной активности этих вирусов в суспензии культуры клеток СПЭВ-17/91 было на 0,5-0,75 lg ТЦД₅₀/мл выше, чем в монослое.

Штамм может быть использован для репродукции вирусов животных при изготовлении средств диагностики и профилактики вирусных болезней животных, а также при проведении вирусологических исследований.

13. Криоконсервационные характеристики
Штамм клеток сохраняют в жидком азоте при -196^oC под защитой криофилактика с 5% этиленгликоля в ростовой среде Игла с 10% сыворотки КРС в стеклянных ампулах до 50 мл, концентрации клеток 10-15 млн/мл. Замораживание проводят со скоростью 1-2^oC в минуту до -70^oC, до -130^oC со скоростью 3-4^oC в минуту, затем в парах жидкого азота и в азоте при -196^oC.

Размораживание клеток проводят путем оттаивания ампул с суспензией клеток в водяной бане при 37-38^oC. Жизнеспособность клеток после размораживания определяют визуально под световым микроскопом, предварительно окрашивая их 0,01% трипановым синим. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 95-98%. Свою исходную скорость роста клетки восстанавливают после 1 пассажа в монослое.

Предложенный штамм культивируемых клеток СПЭВ-17/91 получили следующим образом.

Поступившие из Болгарии клетки СПЭВ были обработаны на 1 пассаже супермутагенами диметилсульфатом и ультрафиолетовыми лучами в аппарате "Изольда", а затем клетки клонировали методом предельных разведений на питательных средах в монослое. В результате получен штамм культивируемых клеток СПЭВ-17/91. Полученную культуру клеток адаптировали к среде Игла-ВНИИЗЖ в течение 5 последовательных пассажей с рассевом 1:2 при посевной концентрации 100-150 тыс. кл. /мл. На каждом пассаже заменяли 20% среды Игла, полученной из Болгарии, средой Игла-ВНИИЗЖ с 10% сыворотки крови КРС. На 4-5 пассажах клетки исследовали на видовую принадлежность, наличие контаминантов и пролиферативную активность. Далее клетки использовали для адаптации к суспензионному способу культивирования.

Для получения клеток СПЭВ-17/91, растущих в суспензии, штамм клеток в течение 10 пассажей выращивали в культуральных сосудах емкостью 1,5 л в модифицированной среде Игла без солей кальция с пируватом натрия и 10% сыворотки крови КРС. Клетки снимали со стекла диспергирующим раствором бесцентрифужным методом. Из матрасов удаляли ростовую среду, монослой дважды отмывали диспергирующим раствором, содержащим 0,02% версена и 0,25% трипсина в соотношении 3: 1 с добавлением 0,5% декстрозы. Затем 30 мл диспергирующего раствора вносили в матрас с монослоем клеток и оставляли на 5 минут при комнатной температуре, после этого диспергирующий раствор сливали. Полученную однородную взвесь, состоящую в основном из одиночных клеток, ресуспензировали в среде Игла без солей кальция с пируватом натрия при pH 7,2 с 10% сыворотки крови КРС и 0,03% глутамина до концентрации 150-200 тыс.кл/мл. Через 48 часов культивирования при достижении культурой плотного монослоя клетки отделяли от стекла покачиванием культуральной среды. Полученную суспензию центрифугировали при 1000 об. /мин в течение 10 мин. Клетки из нескольких матрасов объединяли для получения инокулята в 2•10⁵ кл/мл для посева новой культуры. Процедуру повторяли 15 раз. Таким образом получили 50% клеток, которые могли оседать на поверхность стекла, но не прикрепляться и не распластываться. Эти клетки собирали и в концентрации не менее 5•10⁵ кл/мл помещали во вращающиеся культуральные сосуды и культивировали при 37^oC в среде Игла без кальция и пируватом натрия, 10% сыворотки крови КРС и 0,03% глутамина. Через каждые 24 часа отбирали пробы и подсчитывали жизнеспособные клетки. Через 48 часов клетки осаждали и суспензировали в свежей среде до 5•10⁵ кл/мл. В течение первых 6 пассажей прирост клеток составлял 0,8-1,0 млн кл. /мл при 80-85% жизнеспособных клеток. По мере адаптации клеток к глубинному методу выращивания количество жизнеспособных клеток увеличивалось до 94-98%, при этом их плотность достигала 1,8-2,0 млн кл./мл, а с 20 пассажа - до 2,3 млн. кл./мл через 48 часов культивирования. Полученный штамм клеток заложен на 35 пассаже на хранение в жидком азоте в музей клеток ВНИИЗЖ под авторским наименованием СПЭВ-17/91 и депонирован на дублированное хранение в ВСКК (СХЖ) РАСХН под N 43.

Для расширения использования культуры клеток СПЭВ-17/91 в биотехнологии вакцин и диагностикумов проводили адаптацию путем последовательного пассирования штамма клеток к выращиванию в гидролизатных питательных средах в монослое и в суспензии для культивирования вирусов.

Использовали среды, изготовленные на основе 0,5% гидролизата лактальбумина (ГЛА), 0,25% ФГМ-С и 0,25% ферментативного гидролизата белков крови КРС (ФГБК-С) с добавлением 10% сыворотки крови КРС и 0,03% глутамина. Указанные среды разработаны во ВНИ ящурном институте для выращивания клеток ВНК-21 и вируса ящура в монослое и суспензии (20). Результаты адаптации клеток СПЭВ-17/91 к гидролизатным средам в монослое приведены в таблице 2. Данные, представленные в таблице 2, показывают возможность выращивания постоянной линии клеток СПЭВ-17/91 в стационарных условиях в монослое на полусинтетических питательных средах (ПСПС), на гидролизатных средах с 0,5% ГЛА, с 0,25% ФГМ-С, с 0,25% ФГБК-С с 10% сыворотки крови КРС так же успешно, как и с использованием среды Игла.

Результаты адаптации клеток СПЭВ-17/91 к гидролизатным средам в суспензии показаны в таблице 3.

Данные таблицы 3 свидетельствуют о способности клеток СПЭВ-17/91 размножаться в суспензии на гидролизатных средах, изготовленных с использованием 0,5% ГЛА, 0,25% ФГМ-С или 0,25% ФГБК-С с 10% сыворотки крови КРС.

В целях расширения возможности использования и снижения затрат на культивирование проводили адаптацию клеток к выращиванию в монослое и суспензии с использованием гидролизатных сред с 5% сыворотки крови КРС или лошади. Адаптацию вели в течение 15 последовательных пассажей, при этом в монослое через каждые три пассажа понижали содержание сыворотки в среде на 1%.

Результаты культивирования клеток СПЭВ-17/91 на среде Игла с 5% сыворотки крови КРС и лошади в суспензии приведены в таблице 4. Данные таблицы 4 свидетельствуют о высокой пролиферативной активности адаптированных клеток СПЭВ-17/91 в суспензии при выращивании на среде Игла с 5% сыворотки крови КРС или лошади.

Постоянная линия клеток СПЭВ-17/91 имеет высокую чувствительность к вирусам ящура, ВБС, ВЭС, БГ, БА, ЭН и чумы КРС. Свойства монослойно-суспензионного штамма клеток подтверждены в комиссионных испытаниях и паспортизированы.

Полученный штамм клеток СПЭВ-17/91 имеет следующие отличия от штамма-прототипа:
1. Штамм СПЭВ-17/91 способен размножаться как в монослое, так и в суспензии на полусинтетических питательных средах.

2. В суспензии клетки растут на модифицированной среде Игла без солей кальция с пируватом натрия.

3. Штамм СПЭВ-17/91 формирует монослой при рассеве 1:3 - 1:4 через 72 часа. Монослой сохраняется в течение 10 суток без смены среды.

4. Штамм СПЭВ-17/91 хорошо сохраняются при 4^oC в течение 2 недель и при -196^oC в течение 1 - 5 лет (срок наблюдения) с сохранением 95-98% жизнеспособных клеток. Исходные свойства восстанавливаются на 2-3 пассажах.

5. Штамм СПЭВ-17/91 сохраняет свои генетические свойства в монослое в течение 105 пассажей, в суспензии - 35 пассажей. Штамм стабилен, что дает возможность стандартизировать результаты выращивания клеток и вирусов.

6. Штамм СПЭВ-17/91 обладает высокой чувствительностью и репродукционной способностью в отношении ящура типов A, O, C, Азия-1, ЭН, БГ, БА, ВЭС, ВБС и чумы КРС.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источник, характеризующийся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам заявленного изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности признаков аналога, позволил установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемого штамма.

Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности "новизна".

Для проверки соответствия предлагаемого штамма условию патентоспособности " изобретательный уровень" проведен дополнительный поиск известных решений. Результаты поиска показали, что предлагаемый штамм не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники.

Следовательно, предлагаемый штамм соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень".

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами выращивания вирусов различных таксономических групп в клеточной культуре СПЭВ-17/91, что не ограничивает объем изобретения.

Пример 1
Для репродукции используют вирус ящура A₂₂ штамм 663, адаптированный к культуре клеток СПЭВ-17/91, с титром инфекционной активности 6,0- 7,51 lgТЦД₅₀/мл.

Культуру клеток в монослое выращивают в плоских культуральных сосудах или вращающихся роллерных сосудах в стационарных условиях. Для культивирования клеток используют питательные среды Игла или среды на основе гидролизатов белков мышц, крови или молока КРС с 5% сыворотки крови КРС pH 7,0-7,2. Посевная концентрация клеток - 100-150 тыс.кл/мл. Через 48-72 часа культивирования после образования плотного клеточного пласта ростовую среду удаляют, монослой промывают питательной средой или раствором Эрла. В культуральные сосуды с выросшими клетками вносят вирус ящура в дозе 0,1-1,0 ТЦД₅₀/клетка и в объеме 1:20-1:30 от объема поддерживающей среды. Внесенный вирус инкубируют при 37^oC в течение 60 минут при периодическом покачивании сосуда для смачивания клеточного монослоя вируссодержащей суспензией. Затем вируссодержащую жидкость удаляют и вносят поддерживающую среду без сыворотки, pH 7,4-7,5. Культивирование вируса ведут до полной деструкции клеток монослоя. Полученный вирус замораживают, собирают в общую емкость, определяют его инфекционную и антигенную активность.

Результаты культивирования вируса ящура A₂₂ штамм 663 в монослойной культуре клеток СПЭВ-17/91 приведены в таблице 5.

Пример 2 Для репродукции используют вирус ящура O₁ штамм 194, адаптированный к культуре клеток СПЭВ-17/91, с титром инфекционной активности 6,0-7,5 lg ТЦД₅₀/мл. Культуру клеток в монослое и вирус выращивают так, как описано в примере 1. Результаты опытов по размножению вируса ящура O₁ штамм 194 в монослойной культуре клеток СПЭВ-17/91 представлены в таблице 5.

Пример 3
Для репродукции используют вирус ящура C₁ штамм 564, адаптированный к культуре клеток СПЭВ- 17/91, с титром инфекционной активности 6,0-7,5 lg ТЦД₅₀/мл. Культуру клеток в монослое и вирус выращивают так, как описано в примере 1. Результаты опытов по размножению вируса ящура С₁ штамм 564 в монослойной культуре клеток СПЭВ-17/91 представлены в таблице 5.

Пример 4
Для репродукции используют вирус ящура Азия-1 штамм 48, адаптированный к культуре клеток СПЭВ-17/91, с титром инфекционной активности 6,0-7,5 lg ТЦД₅₀/мл. Культуру клеток в монослое и вирус выращивают так, как описано в примере 1. Результаты опытов по размножению вируса ящура Азия-1 штамм 48 в монослойной культуре клеток СПЭВ-17/91 представлены в таблице 5.

Пример 5
Для репродукции используют вирус ящура A₂₂ штамм 663, адаптированный к культуре клеток СПЭВ- 17/91, с титром инфекционной активности 6,0-7,5 lg ТЦД₅₀/мл. Суспензионную культуру клеток СПЭВ-17/91 разбавляют питательной средой pH 7,4-7,5 до концентрации 1,8-2,0 млн.кл./мл жизнеспособных клеток, вносят в культиватор-ферментер емкостью 1 - 50 л, инфицируют вирусом ящура в дозе 0,1-1,0 ТЦД₅₀/мл, инкубируют в течение 18-24 часов до лизиса 85% и более клеток при постоянном перемешивании и барботировании суспензии воздухом. По окончании инкубирования вируссодержащую суспензию охлаждают, берут пробы для исследования инфекционной и антигенной активности вируса. Результаты опытов по размножению вируса ящура A₂₂ штамм 663 в суспензии клеток СПЭВ-17/91 представлены в таблице 6.

Пример 6
Для репродукции используют вирус ящура O₁ штамм 194, адаптированный к культуре клеток СПЭВ-17/91, с титром инфекционной активности 6,0-7,5 lg ТЦД₅₀/мл. Получение суспензии клеток СПЭВ-17/91 и выращивание в ней вируса осуществляют так, как описано в примере 5. Результаты опытов по размножению вируса ящура O₁ штамм 194 в суспензии клеток СПЭВ-17/91 представлены в таблице 6.

Пример 7
Для репродукции используют вирус ящура C₁ штамм 564, адаптированный к культуре клеток СПЭВ-17/91, с титром инфекционной активности 6,0-7,5 lg ТЦД₅₀/мл. Получение суспензии клеток СПЭВ-17/91 и выращивание в ней вируса осуществляют так, как описано в примере 5. Результаты опытов по размножению вируса ящура C₁ штамм 564 в суспензионной культуре клеток СПЭВ-17/91 представлены в таблице 6.

Пример 8
Для репродукции используют вирус ящура Азия-1 штамм 48, адаптированный к культуре клеток СПЭВ-17/91, с титром инфекционной активности 6,0-7,5 lg ТЦД₅₀/мл. Получение суспензии клеток СПЭВ-17/91 и выращивание в ней вируса осуществляют так, как описано в примере 5. Результаты опытов по размножению вируса ящура Азия-1 штамм 48 суспензионной культуре клеток СПЭВ-17/91 представлены в таблице 6.

Пример 9
Для репродукции используют вирус ВБС штамм 0-72, адаптированный к культуре клеток СПЭВ-17/91, с титром инфекционной активности 6,0-7,5 lg ТЦД₅₀/мл. Получение монослойной культуры клеток СПЭВ-17/91 и выращивание в ней вируса осуществляют так, как описано в примере 1. Результаты накопления вируса ВБС штамм 0-72 в монослое клеток СПЭВ-17/91 представлены в таблице 7.

Пример 10
Для репродукции используют вирус ВБС штамм Т-75, адаптированный к культуре клеток СПЭВ-17/91, с титром инфекционной активности 6,0 lg и выше ТЦД₅₀/мл. Получение монослойной культуры клеток СПЭВ-17/91 и выращивание в ней вируса осуществляют так, как описано в примере 1. Результаты накопления вируса ВБС штамм Т-75 в монослое клеток СПЭВ-17/91 представлены в таблице 7.

Пример 11
Для репродукции используют вирус ВЭС штамм С-72, адаптированный к культуре клеток СПЭВ-17/91, с титром инфекционной активности 6,0 lg и выше ТЦД₅₀/мл. Получение монослойной культуры клеток СПЭВ-17/91 и выращивание в ней вируса осуществляют так, как описано в примере 1. Результаты накопления вируса ВЭС штамм С-72 в монослойной культуре клеток СПЭВ-17/91 представлены в таблице 8.

Пример 12
Для репродукции используют вирус ВЭС штамм A-48, адаптированный к культуре клеток СПЭВ-17/91, с титром инфекционной активности 6,0 lg и выше ТЦД₅₀/мл. Получение монослойной культуры клеток СПЭВ-17/91 и выращивание в ней вируса осуществляют так, как описано в примере 1. Результаты накопления вируса ВЭС штамм A-48 в монослойной культуре клеток СПЭВ-17/91 представлены в таблице 8.

Пример 13
Проведена сравнительная оценка чувствительности к вирусу ящура A₂₂ штамм 663, O₁ штамм 194, C₁ штамм 564 и Азия-1 штамм 48 предложенного штамма клеток СПЭВ-17/91 и штамма-прототипа (Болгария). Клеточные культуры СПЭВ (Болгария) и СПЭВ-17/91 выращивали в монослое на среде Игла с 10% сыворотки крови КРС. Культуру с плотным монослоем инфицируют, вирусом ящура и инкубируют так, как описано в примерах 1-4. Результаты опытов представлены в таблице 9. Данные таблицы 9 свидетельствуют о том, что накопление титра инфекционности вируса ящура в клетках СПЭВ- 17/91 было на 0,75-1,0 lg ТЦД₅₀/мл выше по сравнению с клетками СПЭВ (Болгария).

Пример 14
Проведено сравнительное изучение чувствительности к вирусам ящура, ВБС и ВЭС штаммов клеток домашней свиньи, хранящихся в коллекции ВНИИЗЖ при -196^oC. Вирусы выращивали в монослое клеток СПЭВ-17/91, JB-RS-2, ПСГК-ЗО и СПП на среде Игла с 10% сыворотки крови КРС при множественности заражения 0,1-10 ТЦД₅₀/мл до максимального проявления ЦПД в культуре в последовательности, описанной в примере 1.

Результаты сравнительного изучения чувствительности к вирусам животных штаммов культивируемых клеток свиного происхождения представлены в таблице 10. Данные таблицы 10 свидетельствуют о высокой чувствительности культуры клеток СПЭВ-17/91 к вирусам ящура, ВБС и ВЭС.

Пример 15
Для репродукции используют вирус чумы КРС штамм К-37/70, адаптированный к культуре клеток СПЭВ-17/91, с титром инфекционной активности 6,0 lg и выше ТЦД₅₀/мл. Культивирование клеток в монослое, их инкубирование, инфицирование вирусом осуществляют так, как описано в примере 1. В качестве поддерживающей среды используют среды Игла с ГЛА, с ФГМ-С, с ФГБК-С и ПСПС с 2,0-5,0% инактивированной сыворотки крови КРС. Выращивание вируса в культуре ведут в течение 3-4 суток до максимальной деструкции клеток. Через 24 часа ведут смену поддерживающей среды. Результаты опытов по размножению вируса чумы КРС штамм К-37/70 в монослое клеток СПЭВ-17/91 представлены в таблице 11. Данные таблицы 11 показывают высокую эффективность размножения вируса чумы КРС в клетках СПЭВ-17/91 на средах Игла, ГЛА, ФГМ-С, ФГБК-С и ПСПС.

Таким образом, вышеизложенное свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого штамма культивируемых клеток следующей совокупности условий:
- штамм культивируемых клеток СПЭВ-17/91, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в ветеринарной вирусологии и биотехнологии для репродукции вирусов при вирусологических исследованиях и изготовлении антигенов для диагностики и профилактики вирусных болезней животных;
- подтверждена возможность использования предлагаемого штамма для культивирования вирусов животных различных таксономических групп;
- штамм культивируемых клеток СПЭВ-17/91 обладает более высокой пролиферативной активностью, длительной сохраняемостью клеточного пласта, что позволяет получать большое количество клеточной массы и вируссодержащего культурального материала с высокой инфекционной активностью по сравнению со штаммом- прототипом.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

Источники информации
1. Дьяконов Л.П. и др. Культивирование клеток и тканей животных. Учебно-методическое пособие. Ставрополь, 1988, ч.2, 96 с.

2. Castro M.R. et al. Variation off cell clones derived from tlie JB-RS-2 suhue cell line to the foot-and-mouth disease virus. Arg. Inst. Biol., 1967, 34, 4, 295-299.

3. Пат. Великобритании N 1436323, C6F, A5B, 19.05.76 г.

4. Пат. Франции N 2088038, C 12 K 5/00, 07.01.72 г.

5. Пат. Франции N1526357, C 12 K 16.04.68 г.

6. Балышева В. И. и др. Перспективы культивирования культуры клеток ПСГК в вирусологической практике. Цитология, 1994, т. 36, N6, 544-545.

7. Пат. СССР N 1822345, МПК⁵ A 61 K 39/295, 15.06.93 г.

8. Пат. России N 2061753; МПК⁶ C 12 N 5/06, 7/00; 10.06.96 г.

9. Пат. России N 2065496, МПК⁶ C 12 N 5/02, 20.08.96 г.

10. Царева А.А.И др. Банки клеток-продуцентов биологических препаратов. Цитология, 1992, т.34, N9, 117 с.

11. Старов С.К. и др. Использование перевиваемой линии клеток СПЭВ для изготовления вирусвакцины против чумы КРС из штамма К37/70. Вирусные болезни с.-х. животных. Тез. докл. научно-практ. конф. ВНИИЗЖ. Владимир, 1995, 78.

12. Charman W. G. et al. Growth of the JB-RS-2 pig kidney cell line in suspension culture and its susceptibility to foot- and-mouth disease virus. Appl. Microbiol, 1971, 22, 1, 1-5.

13. Курносов А.Н. и др. О методике адаптации перевиваемых клеток к суспензионному культивированию. Вопросы вет. вирусол., микробиол. и эпизоотол. Тез.докл. научн. конф. ВНИИВВиМ, Покров, 1981.

14. Витина С.А. и др. Использование новой культуры перевиваемых клеток почки свиньи (ПКПС) в ветеринарной вирусологии. Вирусные болезни с.-х. животных. Тез. докл. Всерос. научно-практ. конф., Владимир, 1995, 104.

15. Балышева В.И. и др. Клеточные культуры в биотехнологии. Научные основы технологии и промышленного производства ветеринарных биологических препаратов. Тез. докл. Всерос. научно-практ. конф., Щелково, 1996, 28.

16. Дегтяренко Н.Л. и др. Определение видовой принадлежности постоянной линии клеток ПСГК-30. К новой стратегии борьбы с ящуром. Междунар. конф., Владимир, 1991, 121-122.

17. Куликова К.С. и др. Культивирование вируса ящура в перевиваемых линиях клеток. IV отчетная научн. конф., Московский НИИ ветпрепаратов, М., 1963, 21-22.

18. Куликова К. С. и др. Использование перевиваемой культуры СПЭВ и ее клона при изучении вируса ящура. Акт вопросы вет. вирусол., М., 1965, 23-25 (прототип).

19. Новохатский А.С. Тканевые и клеточные культуры в вирусологии и молекулярной биологии. М., 1979.

20. Инструкция по изготовлению и контролю вакцины моновалентной эмульсионной против ящура типа A, типа O, типа C, типа Азия-1 (из вируса, выращенного в клетках ВНК-21). Утверждена ГУВ МСХ СССР 24.01.91 г.

Изобретение предназначено для изготовления антигенов для диагностики и профилактики вирусных болезней животных. Монослойно-суспензионный штамм культивируемых клеток СПЭВ-17/91 получен путем обработки исходной культуры клеток почки эмбриона свиньи супермутагенами, отбором, селекцией и адаптацией к полусинтетическим питательным средам. Полученный штамм обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками. Чувствителен к вирусам ящура, ВБС, БГ, БА, ЭН, ВЭС и чумы КРС. Репродуцирует клетки в монослое и в суспензии в титрах 5,0-7,5 lg ТЦД₅₀. Хранится в музее клеток ВНИИЗЖ, депонирован на 35 пассаже в суспензии в ВСКК (СХЖ) РАСХ под N 43. Штамм обладает более высокой пролиферативной активностью, длительной сохраняемостью клеточного пласта, что позволяет получать большое количество клеточной массы и вируссодержащего материала с высокой инфекционной активностью. 11 табл.

Штамм культивируемых клеток почки Suis domestica L. ВСКК (СХЖ) РАСХН N 43 для культивирования вирусов животных.