СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТОКСИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ Российский патент 1996 года по МПК A61K35/16 A61K39/00 

Данное изобретение относится к медицинской промышленности, а именно, к производству антитоксических сывороток.

В медицинской промышленности из целого ряда апробированных схем получения антитоксических сывороток основным стал метод солевой преципитации. Так, в промышленном способе получения антитоксических сывороток "Диаферм-3", применяемом уже более 30 лет, осаждение альбумина и иммуноглобулинов проводят сульфатом аммония. Технология "Диаферм-3" схематически выглядит следующим образом (1):
I стадия.

а) Протеолиз пепсином лошадиной гипериммунной сыворотки, разведенной до 3% содержания общего белка, в течение 1 ч при pH 3,2 и 1 ч при pH 4,2.

б) Фильтрация, осадок отбрасывают.

II стадия. Солевая преципитация.

а) Осаждение альбумина: в фильтрат с pH 7,0 7,1 добавляют 14,5% сульфата аммония.

б) Фильтрация, осадок отбрасывают.

в) Осаждение иммуноглобулинов: в фильтрат добавляют 20% сульфата аммония.

г) Фильтрация, фильтрат отбрасывают.

д) Осадок иммуноглобулинов прессуют.

е) Диализ иммуноглобулинов до остаточного содержания сульфата аммония 0,1 0,3% в течение 36 48 ч.

III стадия.

а) Освобождение антитоксина от балластных белков обработкой хлороформом.

б). Сепарирование, осадок балластных белков и хлороформ отбрасывают.

в). Стерилизующая фильтрация.

Способ характеризуется невысоким выходом активного продукта (30 45%), длительностью технологического процесса (7 8 суток), трудоемкостью, большим расходом материалов и водопроводной воды (на диализ в проточной воде в течение 36 48 ч) и использованием экологически вредных реактивов (хлороформ, сульфат аммония). Потери антитоксина составляет 55 65% и более за счет денатурации белков при протеолизе в присутствии сульфата аммония, при диализе и обработке хлороформом, воздействии остающейся в препарате примеси пепсина. В препарате присутствует значительное количество балластных белков (57 75%), представленных α₂- и β- глобулинами.

Наиболее близкой к заявляемому способу является технология "Ультраферм", разработанная в 1968 1972 гг. которая схематически выглядит следующим образом (2):
1. Преципитация балластных белков риванолом.

а). Гипериммунную лошадиную плазму обрабатывают риванолом (этакридина лактат), при этом в осадок переводят альбумин, фибриноген и α-глобулины.

б). Фильтрация, осадок отбрасывают.

2. Протеолиз пепсином в присутствии риванола в течение 1 ч. при pH 3,2 - 3,22 и 1 ч. при pH 3,75 3,8.

3. Обработка ферментата для удаления риванола активированным углем и сорбция балластных белков 30 40% гидроокиси алюминия.

4. Центрифугирование, осадок отбрасывают.

5. Стерилизующая фильтрация иммуноглобулинов.

6. Концентрация антитоксина ультрафильтрацией на керамических свечах, покрытых нитроцеллюлозой.

7. Стандартизация.

8. Стерилизующая фильтрация.

Выход антитоксина составляет 41 45%
Данный способ не стал промышленным.

Целью данного изобретения является повышение выхода и степени чистоты целевого продукта (антитоксина), упрощение технологического процесса. Для достижения поставленной цели гипериммунную лошадиную плазму после обработки риванолом, пепсином и 10% гидроокиси алюминия очищают и концентрируют на ультрафильтрационных мембранах с порогом задержания веществ по молекулярной массе 100 кД, а доочистку от мелкодисперсных примесей проводят микрофильтрацией на мембранах с размером пор 0,2 мкм.

Сравнительный анализ существенных признаков заявляемого способа и прототипа свидетельствует, что общими признаками у них являются: осаждение балластных белков риванолом, протеолиз пепсином, сорбция балластных белков гидроокисью алюминия, концентрирование антитоксина.

Отличительном признаком в предлагаемом способе является использование для очистки и концентрирования ферментированного материала трехстадийного процесса:
а). Сорбция балластных белков 10% гидроокиси алюминия.

б). Очистка и концентрирование антитоксина ультрафильтрацией на мембранах с порогом задержания веществ по молекулярной массе 100 кД, при этом для очистки используют прием диафильтрации.

в). Доочистка препарата от мелкодисперсных примесей микрофильтрацией на мембранах с пористостью 0,2 мкм.

После обработки пепсином ферментат состоит из F_ab-фрагментов Т-глобулинов с молекулярной массой 106 кД (антитоксин) и балластных белков, представленных F_c-фрагментами иммуноглобулинов (молекулярная масса 50 кД), низкомолекулярными белками (пептидами), пепсином (молекулярная масса 35 кД), нерасщепленными глобулинами (липидсодержащие белки a₂-глобулиновых фракций и β₁-глобулины), а также риванола. На примененных мембранах с пределом отсекания 100 кД при ультрафильтрации в фильтрат уходят все компоненты за исключением антитоксина и нерасщепленных глобулинов. Для сорбции последних достаточно небольшого количества гидроокиси алюминия 10% В процессе очистки практически полностью удаляется риванол. Его остаточное содержание колеблется в пределах 150 200 мкг/мл, что не влияет на физические свойства препарата, в частности на показатель цветности (3), и во много раз меньше его разрешенной фармакопейной дозы 50 мг высшая разовая доза внутрь, 150 мг высшая суточная доза внутрь на человека (4).

Таким образом, предложенная в способе совокупность признаков позволяет получать хроматографически гомогенный препарат (рис. 1б) с меньшими затратами на его изготовление, за более короткий срок и с более высоким выходом целевого продукта без изменения фазового состояния антитоксина.

В доступной литературе сведения об использовании мембран с пределом отсекания 100 кД в получении антитоксических сывороток отсутствуют, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого способа критериям "Новизна" и "Изобретательский уровень".

Осуществление способа.

Для приготовления очищенных концентрированных антитоксических сывороток используют гипериммунную лошадиную плазму. Балластные белки: альбумин, фибриноген и α-глобулины осаждают 1,2%-ным водным раствором риванола (1 объем плазмы + 0,5 объема апирогенной дистиллированной воды + 0,5 объема раствора риванола), нагретым до 45^oС. Осадок формируют при температуре 4 8^oC в течение 7 суток.

Протеолиз проводят при комнатной температуре в присутствии риванола под действием 0,03% -ного раствора пепсина 1 ч. при pH 3,2 и 1 ч. при pH 3,75 - 3,8. Затем подщелачивают 2,5 N раствором гидроксида натрия до pH 6,5.

Первичный этап очистки сорбция белковых примесей и риванола на гидроокиси алюминия, добавляемой в количестве 10% проводят в течение 1 ч. при комнатной температуре. Затем осуществляют грубое осветление материала путем освобождения от взвеси гидроокиси алюминия и других частиц на миткалевом фильтре.

Очистку антитоксина и концентрирование проводят на ультрафильтрационной установке, состоящей из вихревого насоса и мембранных аппаратов с пределом отсекания 100 кД. Расчет площади фильтрующей поверхности мембран следующий: 1 м² мембран на 25 л осветленного ферментата. Рабочее давление 0,08 0,12 МПа.

Вначале концентрацию ферментированного материала ведут до 1/5 исходного объема. Затем проводят диафильтрацию в постоянном объеме, для чего при работающей установке постоянно добавляют в концентрат диафильтрующий раствор, состоящий из 0,15 М раствора хлорида натрия на апирогенной дистиллированной воде (физраствор). Скорость подачи диафильтрующего раствора равна производительности ультрафильтрационной установки по периметру (фильтрату), что дает возможность вести процесс диафильтрации при постоянном объема концентрата. Расход диафильтрующего раствора составляет 1/2 исходного объема очищаемого материала.

После диафильтрации проводят окончательную концентрацию, лимитирующим показателем которой является уровень общего белка, допустимый в препарате в пределах 10,5 11,8% (3). Пермеат во время всего процесса ультрафильтрации сбрасывают в канализацию.

Очищенный и сконцентрированный антитоксин перед стерилизующей фильтрацией освобождают от мелкодисперсных примесей микрофильтрацией на мембранах с размером пор 0,2 мкм.

Пример 1. Получение противостолбнячной антитоксической сыворотки.

30 л гипериммунной лошадиной плазмы разбавляют 15 л апирогенной дистиллированной воды и вливают помешивая 15 л 1,2% ного раствора риванола, нагретого до 45^oC. Смесь оставляют на ночь при комнатной температуре. Вносят при помешивании 18 г пепсина, растворенного в 3 л дистиллированной воды. Протеолиз проводят при комнатной температуре 1 ч. при pH 3,2 и 1 ч. при pH 3,75 3,8 (pH доводят до нужного значения 2,5 N раствором соляной кислоты или 2,5 N раствора гидроксида натрия). По окончании протеолиза pH доводят до 6,5, при помешивании добавляют 7 л стерильной взвеси гидроокиси алюминия и проводят сорбцию в течение 1 ч. при комнатной температуре.

Полученную смесь осветляют, пропуская через 8-рамный миткалевый фильтр при давлении 0,04 МПа. Фильтрат собирают в бачок из нержавеющей стали с двумя патрубками, соединенными с подготовленной к работе ультрафильтрационной установкой. При давлении 0,08 0,12 МПа проводят концентрацию материала до 14 16 л, затем диафильтрацию (расход физраствора 35 л) и окончательную концентрацию до объема 3,2 л (содержание общего белка 11,2). Фильтрат во время всего процесса концентрации и очистки сбрасывают в канализацию.

Доочистку сконцентрированного антитоксина проводят на микрофильтрационной установке (мембранный аппарат площадью 1 м²) при давлении 0,03 0,05 МПа в течение 10 15 мин.

Из данных табл. 1 видно, что стабильно высокие титры антитоксина получают на мембранах с порогом отсекания 100 кД. Оптимальное количество гидроокиси алюминия для сорбции 10% (табл. 2), дальнейшее увеличение ее количества не оказывает какого-либо дополнительного положительного эффекта на активность получаемого антитоксина. В табл. 3 показано, что приготовленная предложенным способом противостолбнячная сыворотка по сравнению со способом "Диаферм-3" и "Ультраферм" имеет больший выход при высоком среднем титре. На рис. 1 приведены хроматограммы препаратов, приготовленных сравниваемыми способами. Полученный предложенным способом препарат гомогенен (рис. 1,б), в то время как полученный способом "Диаферм-3" (рис. 1,а) имеет ярко выраженные примеси. Хроматографический анализ сыворотки, полученной методом "Ультраферм" авторами метода не проводился (имеются данные об отсутствии в конечном препарате a₂- и β₁-глобулинов).

Таким образом, заявляемый способ по сравнению с используемым в промышленности аналогом ("Диаферм-3") обеспечивает повышение выхода целевого продукта с 30 45% до 55 80% сокращение технологического цикла с 7 8 суток до 2,5 3 суток, исключает диализ, а также экологически вредные сульфат аммония и хлороформ. Процесс происходит без изменения фазового состояния антитоксина. Препарат хроматографически гомогенен.

По сравнению с прототипом ("Ультраферм") заявляемый способ также обеспечивает повышение выхода целевого продукта (с 41 45% до 55 80%) и, кроме того, снижает количество используемой гидроокиси алюминия с 30 40% до 10% исключает применение активированного угля и стадии центрифугирования, стерилизующей фильтрации (промежуточную) и концентрации антитоксина на керамических свечах, покрытых нитроцеллюлозой.

Предлагаемый способ может быть использован в производстве других видов антитоксических сывороток, поскольку нами получены аналогичные результаты по противодифтерийной и противоботулинической сывороткам (табл. 4). В настоящее время результаты этих опытов обрабатываются по регламентированным в производстве требованиям и будут представлены в случае необходимости экспертизе. ТТТ1 ТТТ2 ТТТ3

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается производства антитоксической сыворотки. Цель изобретения - повышение выхода и степени чистоты целевого продукта, упрощение технологического процесса. Для этого гипериммунную лошадиную плазму обрабатывают риванолом, пеписином и 10% гидроокиси алюминия, затем очищают и концентрируют на ультрафильтрационных мембранах с порогом задержания вещества по молекулярной массе 100 КД. Доочистку от мелкодисперсных примесей проводят микрофильтрацией на мембранах с размером пор 0,2 мкм. Выход целевого продукта составляет 55 - 80%. Препарат хроматографически гомогенен. 1 ил., 4 табл.

Способ получения антитоксической сыворотки путем обработки ее риванолом, пепсином, гидроокисью алюминия, фильтрации с последующей ультрафильтрацией и стерилизующей фильтрацией целевого продукта, отличающийся тем, что обработку проводят 10%-ным раствором гидроокиси алюминия, ультрафильтрацию осуществляют на мембранных аппаратах с порогом задержания веществ по молекулярной массе 100 кД, а перед стерилизующей фильтрацией целевой продукт очищают микрофильтрацией на мембранах с пористостью 0,2 мкм.