ПРЕПАРАТ ГЕТЕРОЛОГИЧНОГО АНТИРАБИЧЕСКОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА ДЛЯ ВНУТРИВЕННОГО И ВНУТРИМЫШЕЧНОГО ВВЕДЕНИЯ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2008 года по МПК A61K39/205 A61K39/395 A61K35/16 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к производству медицинских биологических препаратов, и может быть использовано для получения высокоочищенного гетерологичного антирабического иммуноглобулина для внутримышечного и внутривенного введения.

Бешенство до сих пор остается значимой медицинской и экономической проблемой. Это обусловлено тем, что сохраняется постоянная угроза заражения людей вирусом бешенства в связи с существованием природных очагов заболевания и распространением этой инфекции среди диких и домашних животных [1, 2, 3]. По данным ВОЗ, в мире в среднем каждый год регистрируется 500000 случаев активно-пассивной обработки и 35000-50000 смертей от бешенства [4, 5, 6], причем 90% смертности приходится на развивающиеся страны [7].

Клиническая картина заболевания бешенством характеризуется тяжелым поражением нервной системы и без специфического лечения приводит к 100% летальному исходу. При данном заболевании эффективно применение с целью профилактики - антирабической вакцины - и для лечения - антирабической сыворотки или антирабического иммуноглобулина гетеро- или гомологичного происхождения. Комитет ВОЗ по бешенству рекомендовал применение антител во всех случаях заражения гидрофобией [8].

Применение гетерологичной антирабической сыворотки для профилактики пост-экспозиции бешенства может приводить к осложнениям. Ее введение часто сопровождается аллергическими реакциями в форме сывороточной болезни и связано с риском развития явлений анафилаксии.

Антирабический иммуноглобулин человеческого происхождения (ЧАИГ) отличается хорошей переносимостью и редкими случаями возникновения аллергических реакций, но он недоступен для большинства потребителей. Высокая стоимость и небольшой объем производства, связанный с трудностями иммунизации волонтеров, ограничивает спрос препаратов ЧАИГ в развивающихся странах с низким доходом населения. Кроме того, способ получения гомологичного антирабического иммуноглобулина не может полностью исключить риск возникновения побочных реакций и передачи реципиенту различных возбудителей инфекционных заболеваний, поэтому этот препарат не может считаться абсолютно безопасным [9].

За рубежом на стадии изучения находится вопрос получения моноклональных антител к вирусу бешенства, использование которых должно способствовать снижению развития постэкспозиционного анафилактического шока. Недостатками препаратов нового поколения являются: отсутствие практической базы клинического применения; узкая специфичность действия; возможность мутации антигенного состава вируса бешенства; необходимость очищать моноклональные антитела до экстремально высокого уровня, сложные методы контроля, что ведет к высокой себестоимости препарата.

Экономичнее (приблизительно в пять раз, чем ЧАИГ) профилактика и лечение бешенства очищенным лошадиным антирабическим иммуноглобулином (ЛАИГ). Последнее поколение очищенного ЛАИГ намного безопаснее лошадиной антирабической сыворотки, его можно считать приемлемой и безопасной альтернативой ЧАИГ. Правда, за последнее двадцатилетие все мировые производители (Behring, Sclavo, Bema) из-за давления, которое оказывают на них защитники прав животных, отказались от производства ЛАИГ [10]. В развивающихся странах, где бешенство особенно распространено, производством ЛАИГ занимаются национальные фармацевтические компании. Их препараты плохо очищены от балластных белков и обладают высокой реактогенностью [11]. Низкое качество и небольшой объем производства не удовлетворяют национальные потребности и не решают проблему дефицита ЛАИГ.

М.А.Селимов с соавторами предложил получать ЛАИГ иммунизацией лошадей-продуцентов фиксированным вирусом бешенства, выращенным на культуре первичных клеток почек сирийских хомяков (ПСХ) или новорожденных морских свинок [12].

Известный способ не предусматривает очистку антигена от бычьей сыворотки и клеточного детрита. Балластные белки и другие антигенные вещества, имеющие источником происхождения питательную среду, на которой происходил рост вируса, являясь часто полноценными антигенами, вызывают при иммунизации образование соответствующих неспецифических по отношению к антигену антител, чем усиливают реактогенность серопрепаратов и их сенсибилизирующие свойства [13]. Кроме того, в данном способе получения антирабического иммуноглобулина не раскрыт метод выделения γ-глобулиновой фракции.

Известен способ получения антирабической сыворотки иммунизацией овец гомологичной мозговой суспензией, инфицированной вирусом бешенства [14].

Недостатком указанного способа является использование для получения антирабической сыворотки неочищенной 5% мозговой суспензии, применение которой в качестве субстрата репродукции вируса приводит к образованию и накоплению в сыворотке продуцентов цитотоксических антимозговых антител (цитотоксинов), которые являются одной из причин реактогенности серопрепаратов и вызывают побочные реакции при ведении человеку [15]. К тому же есть вероятность заражения животных-продуцентов прионами, которые могут содержаться в неочищенном антигене.

Известны методы очистки и концентрации антитоксических сывороток Диаферм-3 и Просдис-2 [16]. Наряду с достоинствами эти методы имеют ряд существенных недостатков, одними из которых являются невысокая электрофоретическая чистота, низкий выход специфической активности и возможность пирогенизации препарата на стадии диализа.

Известен способ фракционирования белков антирабической сыворотки по варианту Томского НИИВС, разработанный Н.Б.Плаховой, В.Г.Механиковой и А.И.Деевой (1960 г.), по которому гамма-глобулиновую фракцию выделяют спиртовым осаждением на холоду при рН 6,4 и разведении глобулинов в тройном объеме физиологического раствора [16].

Недостатками указанного способа являются трудоемкость и многостадийность процедуры выделения белков, узость интервалов физико-химических констант, при которых производится фракционирование, сравнительно высокие потери белков в процессе производства, значительное расходование спирта, необходимость проведения всего процесса при низких температурах, что требует большого количества холодильного оборудования. Кроме того, у гетерологичных иммуноглобулинов, полученных методом спиртового фракционирования, наиболее выражены сенсибилизирующие свойства [17].

Известен способ получения иммуноглобулинового препарата для профилактики и лечения инфекционных заболеваний человека и животных из сыворотки крови крупного рогатого скота, включающий коагуляцию и удаление балластных белков и липидов каприловой кислотой [18].

Недостатком известного способа является то, что в процессе получения иммуноглобулинового препарата не происходит концентрации титра специфических антител. Титр антител в конечном препарате остается на том же уровне, что и в исходной сыворотке. Данный способ позволяет получить пероральные иммуноглобулиновые препараты для профилактики и лечения кишечных инфекционных заболеваний человека и животных, а также препараты для лечения и профилактики инфекционных заболеваний крупного рогатого скота для внутримышечного и внутривенного введения. Известный препарат не предназначен для внутримышечного и внутривенного введения человеку.

В РФ и странах СНГ зарегистрированы два препарата ЛАИГ для внутримышечного введения фирмы «Биолек» (Украина) и РосНИПЧИ «Микроб» (Россия), получаемые по одной технологии, включающей выделение γ-глобулиновой фракции риванол-спиртовым методом, и имеющие одинаковые показатели качества [19, 20].

Прототипом настоящего изобретения выбран препарат ЛАИГ фирмы «Биолек» (Украина), который давно известен на российском рынке.

Получение известного препарата риванол-спиртовым методом фракционирования предусматривает использование риванола, который относится к вредным веществам и относится к III классу опасности [21]. Предельно допустимая концентрация риванола в воздухе рабочей зоны 2 мг/м³. В настоящее время риванол практически снят с производства в России и почти во всех странах мира. Высокая стоимость зарубежного риванола делает его малодоступным для применения в крупномасштабном производстве гетерологичного антирабического иммуноглобулина. В настоящее время риванол не используется для получения гомологичного иммуноглобулина. Кроме того, трудоемкость процесса фракционирования риванолом, необходимость многократного разведения плазмы для избежания денатурации белка затрудняют процесс получения γ-глобулина [22].

Электрофоретическая однородность, заложенная в ФСП на ЛАИГ фирмы «Биолек», предусматривает невысокое содержание γ-глобулинов - не менее 80% и высокое α- и β-глобулинов - не более 20%, которые обладают высокой сенсибилизирующей активностью и могут привести к возникновению побочных реакций. По данным Б.Л.Черкасского (1985 г.) препарат ЛАИГ фирмы «Биолек» вызывает побочные аллергические реакции у 20-40% прививаемых [23].

В ФСП на известный препарат не заложены молекулярные параметры. Согласно требованиям Европейской Фармакопеи на иммунные сыворотки животного происхождения для человеческого использования [24] в гетерологичных сывороточных препаратах обязателен контроль молекулярных параметров, с которыми связаны анафилактическая и антикомплементарная активности (АКА) [17]. Также Европейской Фармакопее не соответствует концентрация белка в препарате, которая не должна превышать 10%.

Изоэлектроэлектрическая точка иммуноглобулина лежит между значениями рН 5,8-7,3, поэтому жидкие препараты иммуноглобулина с величиной рН 7,0 являются неустойчивыми и при хранении склонны к спонтанному увеличению АКА.

Все серопрепараты должны соответствовать осмолярности изотонического раствора и быть максимально близки к 300 мОсм/кг. Осмолярность антирабического иммуноглобулина фирмы «Биолек» и РосНИПЧИ «Микроб» находится на границе нормы - 600 мОсм/кг. Кроме того, они должны контролироваться на содержание всех веществ, добавленных в процессе получения. Применяемый в известном препарате стабилизатор гликокол в готовом препарате не определяется. Кроме того, препарат не контролируется на наличие антител к субстрату, на котором выращивают вирус бешенства.

Известные способы получения гетерологичного антирабического иммуноглобулина не позволяют получить препарат с высокой степенью очистки, пригодный для внутривенного введения. Качество гетерологичного антирабического иммуноглобулина зависит не только от метода фракционирования, но и от качества антигена, которым иммунизируют животных-продуцентов, т.е. от субстрата, на котором получают вирус бешенства, и степени очистки вируса от балластных белков. Таким образом, проблема получения высокоочищенного гетерологичного антирабического иммуноглобулина не разрешена до сих пор.

Задачей, на решение которой направленно изобретение, является получение высокоочищенного гетерологичного антирабического иммуноглобулина для внутривенного и внутримышечного введения.

Технический результат предлагаемого способа заключается в разработке промышленного способа получения вирусобезопасного гетерологичного антирабического иммуноглобулина из высокоспецифичной гетерологичной антирабической сыворотки каприлатно-спиртовым методом с пепсиновой обработкой и получении высокоочищенного гетерологичного антирабического иммуноглобулина для внутривенного и внутримышечного введения, стабильного при хранении и транспортировке.

Сущность изобретения заключается в следующем: в качестве исходного сырья для получения антирабического иммуноглобулина используют высокоспецифичную гетерологичную антирабическую сыворотку, полученную от иммунизации животных-продуцентов (лошадей, мелкого рогатого скота, свиней) очищенным вирусом бешенства, выращенным на культуре клеток Vero или ПСХ, в которой антитела к клеткам Vero или ПСХ менее 0,5 мкг/мл [25], которую обрабатывают каприловой кислотой, пепсином и этанолом. Обработку пепсином проводят в присутствии мальтозы 0,5-3,0% и при содержании хлоридов 0,2-3,0%. Избыточное содержание натрия хлорида и остаточное содержание каприловой кислоты, пепсина и этанола удаляют диализом и/или ультрафильтрацией, или ионообменной хроматографией, или активированным углем. В готовый препарат вводят глицин в концентрации 0,7-1,5%, содержание натрия хлорида доводят до 0,1-0,45%, мальтозы до 0,5-3,0%. Комбинацию глицина, натрия хлорида и мальтозы выбирают в таких концентрациях, чтобы обеспечить осмолярность препарата в пределах 250-350 мОсм/кг. Устанавливают величину рН 5,0-7,5, содержание белка 4,5-10,0%. Конечный препарат по выбору впоследствии получают в жидкой или сухой форме.

Заявленный способ позволяет получить высокоочищенный гетерологичный антирабический иммуноглобулин для внутривенного и внутримышечного введения, стабильный при хранении и транспортировке, который представляет собой F(ab)₂-препарат со специфической активностью не менее 150 МЕ/мл, с концентрацией белка в растворе 4,5-10,0%, в котором содержание γ-глобулиновой фракции составляет не менее 90,0%, α- и β-глобулинов - менее 9,0%, альбумин - менее 1,0%, имеющий молекулярно-массовое распределение: агрегаты менее 1,0%, димеры и мономеры менее 10,0%, F(ab)₂-фрагменты не менее 84,0%, Fab- и Fc-фрагменты менее 5,0%, АКА менее 1,0 СН 50/мг белка, антитела к клеткам Vero или ПСХ - менее 0,5 мкг/мл.

В отличие от прототипа в заявленном способе в качестве животных-продуцентов помимо лошадей используют мелкий рогатый скот и свиней. В качестве исходного сырья используют высокоспецифичную сыворотку, полученную от иммунизации продуцентов очищенным вирусом бешенства, выращенным на культуре клеток Vero или на первичной культуре клеток ПСХ, в которой антитела к клеткам субстрата менее 0,5 мкг/мл. Фракционирование осуществляют каприлатно-спиртовым методом с пепсиновой обработкой, которую проводят в присутствии мальтозы при концентрации 0,5-3,0% и при содержании хлоридов 0,2-3,0%. Избыточное содержание натрия хлорида и остаточное содержание каприловой кислоты, пепсина и этанола удаляют диализом или ультрафильтрацией, или ионообменной хроматографией, или активированным углем. Конечный препарат иммуноглобулина содержит мальтозу в концентрации 0,5-3,0%, глицин 0,7-1,5%, натрия хлорид 0,1-0,45%, белок 4,5-10,0%, имеет величину рН 5,0-7,5 и может быть получен в сухой форме. Комбинация вспомогательных веществ выбирается в концентрациях, обеспечивающих осмолярность препарата в пределах 250-350 мОсм/кг.

В заявленном препарате гетерологичного антирабического иммуноглобулина увеличен нормативный предел электрофоретической однородности. Повышена удельная активность препарата. В готовом препарате контролируют содержание молекулярных параметров, антител к субстрату, на котором был получен вирус бешенства, АКА, и содержание всех веществ, добавленных и остающихся в нем после технологической обработки. Снижено остаточное содержание этанола до 0,1%. Заявленный препарат предназначен и для внутривенного введения.

Совокупность отличительных признаков заявленного способа позволяет получить следующие преимущества.

Использование в качестве сырья высокоспецифичной гетерологичной антирабической сыворотки, полученной от иммунизации животных-продуцентов очищенным вирусом бешенства, выращенным на культуре клеток Vero или ПСХ, а также контроль исходной сыворотки и конечного препарата на содержание антител к субстрату, на котором был получен вирус, позволяют существенно снизить реактогенность гетерологичного антирабического иммуноглобулина. Необходимость введения данного контроля обусловлена возможностью возникновения у кроликов породы Шиншилла анафилактической реакции после внутривенного ведения гетерологичного антирабического иммуноглобулина, содержащего повышенный уровень антител субстрату [26].

Использование для фракционирования каприловой кислоты предусматривает более щадящую и высокую очистку от балластных белков и липидов, инактивацию оболочечных вирусов на 4-5 логарифмов [27], возможность проводить процесс фракционирования при комнатной температуре и в нестерильных условиях.

Пепсиновая обработка в присутствии мальтозы 0,5-3,0% и при содержании хлоридов 0,2-3,0% позволяет практически получить только F(ab)₂-препарат, предотвратить образование агрегатов и снижение титра антител из-за неконтролируемого протеолиза. Гидролиз балластных белков позволяет повысить электрофоретическую однородность, снизить количество агрегатов и АКА. Тем самым существенно уменьшить анафилактическую активность иммуноглобулинового препарата за счет максимального расщепления наиболее реактогенной части антител - Fc-фрагмента [28].

Выделение γ-глобулиновой фракции этанолом способствует значительной концентрации протективных антирабических (противовирусных) антител и повышению специфической активности препарата.

Обработка сыворотки каприловой кислотой, пепсином и этанолом существенно увеличивает электрофоретическую однородность и удельную активность препарата, обеспечивает инактивацию и удаление возможно присутствующих в плазме вирусов, патогенных для человека, и тем самым гарантирует безопасность заявленного препарата. Процесс фракционирования экономичен, фракционирующие агенты доступны.

Применение диализа, ультрафильтрации, ионообменной хроматографии, активированного угля позволяет эффективно очистить препарат от каприловой кислоты, пепсина, этанола и избытка натрия хлорида. Кроме того, эти методы эффективны в удалении пирогена.

Совокупность используемых стабилизаторов обеспечивает осмолярность препарата, соответствующую нормам Европейской Фармакопеи, - не менее 240 мОсм/кг (29) и стабильность показателей качества ВВИГ препарата (молекулярных параметров, АКА, специфической активности) во время хранения и транспортировки (табл.2, 3). Кроме того, при сублимационном высушивании использование мальтозы в концентрации 0,5-3,0% позволяет предотвратить образование агрегированных форм иммуноглобулина и способствует стабильности АКА. Используемые в качестве стабилизатора мальтоза и глицин отличаются хорошей переносимостью при внутривенном пути введения за счет способности почечных клеток метаболизировать эти вещества.

В конечном препарате снижено содержание натрия хлорида до концентрации 0,1-0,45%, высокое содержание которого является причиной температурной нестабильности, агрегации, мутности, снижения титров антител в препаратах иммуноглобулина [30] и может привести к развитию ацидоза или клеточной дегидратации [31].

Кислое значение рН 5,0-6,0 повышает стабильность качественных характеристик ВВИГ, отличается лучшей переносимостью при внутривенном введении и позволяет получать препарат в жидкой форме со стабильными параметрами [24]. Жидкая форма значительно снижает стоимость препарата и является более удобной для потребителя.

Лиофилизированная форма препарата обеспечивает большую стабильность показателей во время хранения и транспортировки, а также увеличивает срок годности целевого продукта.

Согласно требованиям Европейской Фармакопеи на ВВИГ [29] препарат контролируют на содержание всех веществ, добавленных в него и остающихся в нем после технологической обработки (табл.1).

Введен контроль содержания молекулярных параметров и АКА, которые являются показателями безопасности внутривенных иммуноглобулинов (ВВИГ). Молекулярные параметры имеют молекулярно-массовое распределение: агрегаты менее 1,0%, димеры и мономеры менее 10,0%, F(ab)₂-фрагменты не менее 84,0%, Fab- и Fc-фрагменты - менее 5,0%, АКА менее 1,0 СН50/мг белка.

Соответствие препарата требованиям, предъявляемым для ВВИГ, и стабильность указанных показателей при хранении и транспортировке (табл.1, 2, 3) делает его пригодным для внутривенного введения. Внутривенный путь введения имеет преимущество во времени действия и позволяет получить максимальный эффект за короткий промежуток времени, что особенно важно в серьезных случаях заражения бешенством, когда терапию оказывают несвоевременно. Эффект действия будет наступать уже через 20 мин после внутривенного введения, а не на вторые-третьи сутки, когда препарат вводится внутримышечно.

Удельная активность заявленного препарата выше прототипа в 1,5 раза, следовательно, снижена нагрузка чужеродного белка и, соответственно, реактогенность препарата.

Очищенный гетерологичный антирабический иммуноглобулин, полученный из крови свиней и мелкого рогатого скота, может быть менее реактогенным в связи с тем, что организм человека не сенсибилизирован к их белку и в силу видовой особенности их сыворотки. Так В.В.Пушкарев (1970) показал, что наиболее выраженные анафилактогенные свойства нативных сывороток были выявлены у лошадиных сывороток, затем в убывающей последовательности - у свиней, баранов, быков, наименее анафилактогенными были козьи сыворотки.

Препарат гетерологичного антирабического иммуноглобулина контролировался по следующим методикам.

Электрофоретическая однородность методом электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы (ФС 42-3874-99, с.20). Молекулярные параметры методом гельфильтрации (ФС 42-3874-99, с.28). Антикомплементарная активность - 1 мг белка иммуноглобулина не должен потреблять более 1 ед. (СН50) комплемента (МУК 3.3.2.1063-010). Специфическая активность в тесте протективной защиты in vivo на белых беспородных мышах массой (10±1) г с фиксированным вирусом бешенства штамм CVS против 100-1000 LD₅₀ относительно отраслевого стандартного образца специфической активности антирабического гаммаглобулина (ОСО 42-28-200-92). Содержание антител к клеткам Vero и ПСХ методом ракетного иммуноэлектрофореза, чувствительность метода 0,5 мкг/мл. Натрия хлорид по ФС 42-3874-99, с.59. Определение глицина по МУК 4.1/4.2.588-96, с.114. Содержание мальтозы определяли колориметрически (с реактивом Фелинга) и качественно (хроматографией на бумаге). Определение каприловой кислоты методом ион-эксклюзионной хроматографии [32]. Остаточный этанол по МУК 4.1/4.2.588-96, с.107. Протеолитическую активность определяли в пересчете на 1 мкг тирозина [33]. Осмолярность смотрели на аппарате милиосмометре МТ-4. Исследование стабильности препарата проводили в тестах на перемешивание и ускоренное старение. Тест на перемешивание, который является аналогом условий транспортировки препарата, осуществлялся путем перемешивания в течение 2 ч при частоте 80 горизонтальных осцилляций в минуту при температуре 20°С. Тест на ускоренное старение осуществлялся выдерживанием препарата в термостате при температуре 37°С в течение 4 недель и является аналогом условий хранения в течение 2 лет [29].

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. В качестве исходного сырья для фракционирования используют 100 л антирабической сыворотки, полученной от иммунизации лошадей очищенным вирусом бешенства штамм Внуково-32, выращенным на культуре клеток Vero, в которой специфическая активность составляет 75 МЕ/мл, антитела к клеткам Vero менее 0,5 кг/мл. Сыворотку разбавляют до содержания белка 2%, устанавливают рН 4,2, добавляют каприловую кислоту из расчета 20 г/л при температуре (22±2)°С и постоянном перемешивании в течение 1 ч. После чего осадок удаляют, а в центрифугат вводят мальтозу в концентрации 3,0% и натрия хлорид 0,2%, устанавливают величину рН 3,2-3,3 и добавляют пепсин в концентрации 1-3 г/л. Гидролиз проводят в течение 1 ч при температуре (22±2)°С. Фермент удаляют активированным углем 5-10 г/л при значении рН 6,0-6,1. Затем при величине рН 7,0 и температуре минус 5°С добавляют этанол до концентрации 25% в растворе. Полученный осадок диализируют против 0,45% натрия хлорида. Остаточное содержание каприловой кислоты, пепсина и этанола удаляют путем повторной диафильтрации на ультрафильтрационной установке с использованием дистиллированной воды. После этого доводят содержание мальтозы до концентрации 2,0%, хлоридов до 0,1%, вводят глицин в концентрации 1,5%, устанавливают содержание белка в растворе 4,5-5,0%, величину рН 5,0-5,5 и подвергают стерилизующей фильтрации. Получают жидкий гетерологичный антирабический иммуноглобулин для внутривенного введения с электрофоретической однородностью: γ-глобулины 96,6%, α- и β-глобулины 3,2%, альбумин 0,2%; имеющий молекулярно-массовое распределение: агрегаты 0,0%, димеры и мономеры - 5,2%, F(ab)₂-фрагменты 92,5%, Fab- и Fc-фрагменты - 2,3%, в котором АКА 0,1 СН50/мг, специфическая активность 440 МЕ/мл, антитела к клеткам Vero отсутствуют, осмолярность готового препарата 350 мОсм/кг.

Пример 2. Для фракционирования используют 100 л антирабической сыворотки, полученной от иммунизации свиней очищенным вирусом бешенства штамм Внуково-32, выращенным на культуре клеток ПСХ, в которой специфическая активность 80 МЕ/мл, антитела к клеткам ПСХ менее 0,5 кг/мл. Сыворотку обрабатывают каприловой кислотой, как описано в примере 1. После чего проводят гидролиз в присутствии мальтозы 0,5% и содержании хлоридов 3,0%. Остаточный пепсин, продукты расщепления и липопротеины удаляют с использованием анионообменника ДЭАЭ-сефарозы, который добавляют 10 г/л. Обработку этанолом проводят, как описано в примере 1. Полученный осадок подвергают диализу и проводят ультрафильтрацию. В качестве стабилизатора вводят глицин в концентрации 0,7%, доводят содержание мальтозы до 0,5% и хлоридов до 0,45%. Устанавливают содержание белка 5,0-5,5%, величину рН 6,5-7,0. Препарат подвергают стерилизующей фильтрации и сублимационному высушиванию. Получают сухой гетерологичный антирабический иммуноглобулин для внутривенного введения с электрофоретической однородностью: γ-глобулины 95,8%, α- и β-глобулины 4,0%, альбумин 0,2%; АКА 0,1 СН50/мг и следующими молекулярными параметрами: агрегаты 0,0%, димеры и мономеры 6,0%, F(ab)₂-фрагменты не менее 90,8%, Fab- и Fc-фрагменты - 3,2%, в котором специфическая активность составляет 520 МЕ/мл, антитела к клеткам Vero отсутствуют, осмолярность препарата 295 мОсм/кг.

Пример 3. Сырьем служит сыворотка, полученная от иммунизации овцы очищенным вирусом бешенства штамм Внуково-32, выращенным на культуре клеток Vero, в которой специфическая активность 78 МЕ/мл, антитела к клеткам Vero отсутствуют. Сыворотку обрабатывают каприловой кислотой, как описано в примере 1. Обработку пепсином ведут при содержании: мальтозы 1,5% и хлоридов 1,0%. Удаление пепсина и низкомолекулярных продуктов расщепления из раствора иммуноглобулина проводят диализом, для чего раствор заливают в диализную трубку и диализируют против воды при рН 4,0. После чего обрабатывают этанолом, как описано в примере 1. Полученный осадок γ-глобулинов подвергают диализу против 0,45% натрия хлорида, затем концентрированию ультрафильтрацией. В качестве стабилизатора используют глицин в концентрации 1,0%, доводят содержание мальтозы до 3,0%, натрия хлорида до 0,3%, содержание белка 9,5-10,0%, величину рН 6,5-7,0. Конечный препарат подвергают стерилизующей фильтрации. Получают жидкий гетерологичный антирабический иммуноглобулин с электрофоретической однородностью: γ-глобулины 97,3%, α- и β-глобулины 2,4%, альбумин 0,3%, АКА 0,2 СН50/мг и молекулярными параметрами: агрегаты 0,0%, димеры и мономеры 8,1%, F(ab)₂-фрагменты не менее 88,1%, Fab- и Fc-фрагменты - 3,8%, в котором специфическая активность составляет 505 МЕ/мл, антитела к клеткам Vero отсутствуют, осмолярность готового препарата 350 мОсм/кг.

Источники информации

1. Величко М.А. Бешенство - актуальная проблема здравоохранения // Воен. - мед. журн. - 1994. - №2. - С.47-49.

2. Селимов М.А. Современная эпизоотическая ситуация и перспектива элиминации бешенства // Вопросы вирусологии. Москва, 1998, - №5. - С.196-198.

3. Черкасский Б.Л., Кноп А.Г., Ведерников В.А. и др. Эпидемиология и эпизоотология бешенства на территории бывшего СССР // Журн. микробиол. - 1995. - №1. - С.21-26.

4. Baer, G.M. In: Kurstares Control of Virus Diseases. - New York, Marcel Dekker, - 1984. - P.86.

5. Connelly K.P. Pets and pests: Misconceptions about Zoonotic infections. // Infect. Med. - 2004. - №21, Vol.11. - P.557-65.

6. Hashmi A, Parviz S, Moosvi B, Rehman A, Luby S. Rabies deaths in Karach // Proceeding of the 2^nd National Symposium on Basic and Applied Resarch in Health Care and Social Development, Karachi: Aga Khan University, 1995. - P.151.

7. Wilde H. et al. Rabies in Thailand // Rev. Infect. Dis. - 1993. - №13. - P.644-52.

8. World Health Organization (WHO). Recommendations on rabies postexposure treatment and the correct technique of intradermal immunization against rabies // WHO.EMC.ZOO 96.6. Geneva, 1996.

9. Faure A. Human blood fractionation // 8^th Intern. Biotech. Symp. Paris, 1988. - P.669-678.

10. Wilde, H. Postexposure treatment of rabies infection: can it be done without immunoglobulin? / H.Wilde, P.Khawplod, T.Hemachudha, V.Sitprija // Clin. Infec. t Dis. - 2002. - №34, Vol.4. - P.477-80.

11. Wilde, H. Heterologous antisera and antivenins are essential biologicals: perspectives on a worldwide crisis / H.Wilde, P.Thipkong, V.Sitprija, N.Chaiyabutr // Ann. Intern. Med. - 1996. - №. 125, Vol.3 - P.233-6.

12. Авторское свидетельство СССР №200743. Способ производства антирабического гамма-глобулина. А61К 37/06. Опубл. 05.04.1977.

13. Воробьев А.А // Журнал Микробиол., Эпидемиол. и Иммунобиол. - 1954. - №8. - С.59.

14. Патент РФ №2196607. Способ получения гипериммунной антирабической сыворотки. А61K 39/205, А61K 39/42, G01N 33/569. Опубл. 20.01.2003.

15. Селимов М.А. // Бешенство. Москва, 1978. - С.336.

16. Гипериммунные сыворотки / С.П.Карпов, С.М.Прегер, Г.Е.Синельников, Ю.В.Федоров // Томск, 1976. - С.129-156.

17. Немов В.В. Сравнительное изучение сенсибилизирующей активности гетерологичных сывороточных препаратов // ЖМЭИ. Москва, 1985. - №7. - С.63-67.

18. Патент РФ №2111001. Способ получения иммуноглобулинового препарата. А61K 35/16. Публ. 20.05.1998 г.

19. ФСП 42-0020441303 на иммуноглобулин антирабический из сыворотки крови лошади жидкий. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб».

20. ФСП 42-412 ВС-93 на иммуноглобулин антирабический из сыворотки крови лошади жидкий. Харьковское предприятие «Биолек».

21. Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны (Дополнение №9 к Перечню ПДК от 26.05.88 №4617-88) // Госкомсанэпиднадзор 20.10.93.

22. Фракционирование белков плазмы в производстве препаратов крови / Русанов В.М., Скобелев Л.И. // Москва, 1983. - С.84-85.

23. Б.Л.Черкасский. Эпидемиология и профилактика бешенства // Монография. - 1985.

24. Immunosera for human use, animal. // European Pharmacopoeia 4^th edition 4.06. 01/2003:0084.

25. Заявка на изобретение РФ №2006126555. Способ получения высокоспецифичной гетерологичной антирабической сыворотки. А61K 39/205, А61K 39/42.

26. Ситник Н.П., Исрафилов А.Г., Кулагин В.Ф., Загидуллин Н.В., Алсынбаев М.М., Шафеева Р.С., Шамсувалеева А.К., Крутилина Д.В., Кудашева Г.Б., Латыпова Д.Р. I. Разработка метода сорбции антител, вызывающих пирогенную, анафилактическую реакции при контроле на пирогенность препарата гомологичного и гетерологичного антирабического иммуноглобулина // Реабилитация в медицине и иммунореабилитация: VIII Международный конгресс. - Канны, Франция. - 2002.

27. Johnston A., Uren E., Johnstone D., Wu J. Low pH, caprylate incubation as a second viral inactivation step in the manufacture of albumin. Parametric and validation studies // J. Biologicals. - 2003. - 31, Vol.3. - P.213-234.

28. Шемеровская Т.Г., Немов В.В., Киселева И.А., Софронов Б.Н. Сравнительное изучение иммуногенных и толерогенных свойств препаратов иммуноглобулинов в зависимости от их молекулярного состава // Ж. Иммунология. - Москва, 1982. - №4. - С.60-63.

29. Европейская Фармакопея. Изд. III-2000, V.2.6.20, монография №0918.

30. Oncley J.I, Melin M., Richert D.A. et al. The separation of antibodies, isoagglutinins, prothrombin, plasminogen and beta lipoproteins into sub-fractions of human plasma // J. Am. Chem. Soc. - 1949. - V.71. - P.541-550.

31. Stiller S., Bonnie-Shorn et al. A critical review of sodium profiling for hemodialysis // Seminars in dialysis. - 2001. - V.14 (Suppi 5). - P.337-347.

32. Кузьменко А.Н. и др. Определение каприлат-ионов в препарате крови «Раствор альбумина 10% для инфузий методом ион-эксклюзионной хроматографии // Сб. трудов службы гос. контроля. Качество, эффективность, безопасность средств трансфузионной и инфузионной терапии. Москва, 2005. - С.144-146.

33. Европейская Фармакопея. 1995. - С.255.

Таблица 1Характеристика гетерологичного антирабического иммуноглобулина, полученного по заявленному способу и прототипу, на момент получения№ п/пПоказателиЗаявляемый способ M±SD (n=8)Прототип M±SD (n=8)Р1Электр. однород., %γ-глобулин96,51±1,8987,23±1,59Р<0,05α-, β-глобулин3,26±0,6812,63±1,65Р<0,05Альбумин0,23±0,160,14±0,13Р>0,052Молекуляр. параметры, %Агрегаты0,04±0,110,04±0,05Р>0,05Димеры и мономеры5,21±0,8511,99±1,16Р<0,05(Fab)₂-фрагменты92,47±1,7270,86±2,34Р<0,05Фрагменты (Fab+Fc)2,28±0,8717,11±0,73Р<0,053АКА, СН50/мг белка0,11±0,060,16±0,17Р>0,054Специфическая активность, МЕ/мл439,38±17,82290,00±24,93Р<0,055Удельная активность, МЕ/мг11,80±0,947,6±0,97Р<0,056Каприловая кислота, %0,03±0,01--7Этанол, %0,01±0,040,10±0,13Р<0,058Натрия хлорид, %0,30±0,110,90±0,30Р<0,059Глицин %1,00±0,272,13±0,10Р<0,0510Мальтоза, %1,75±0,79--11Осмолярность, мОсм/кг300±30,24525±75,59Р<0,0512Протеолитическая активность, мкг тирозина/мл (мМ)0,13±0,075,80±0,50Р<0,05Примечание: А - агрегаты, Д - димеры, М - мономеры.
АКА - антикомплементарная активность иммуноглобулина.

Таблица 2Характеристика жидких форм препаратов гетерологичного антирабического иммуноглобулина, полученных по заявленному способу и прототипу, в тесте на ускоренное старение (прогревание при 37°С в течение 28 сут)№ п/пПоказателиЗаявляемый способ, М±SD (n=8)Прототип, М±SD (n=8)P_1,3Р_2,4до обработки (1)после обработки (2)P_1,2до обработки (3)после обработки (4)Р_3,41Молекулярные параметры, %А0,04±0,110,26±0,18Р>0,050,04±0,051,94±0,38Р<0,05Р>0,05Р<0,05Д+М5,21±0,855,80±1,29Р>0,0511,99±1,1611,11±0,81Р>0,05Р<0,05Р<0,05(Fab)₂92,47±1,7289,93±1,25Р>0,0570,86±2,3466,65±1,78Р<0,05Р<0,05Р<0,05Fab+Fc2,28±0,874,01±0,56Р>0,0517,11±0,7320,30±0,78Р<0,05Р<0,05Р<0,052АКА, СН50/мг белка0,11±0,060,19±0,09Р>0,050,16±0,171,00±0,18Р<0,05Р>0,05Р<0,053Специфическая активность, МЕ/мл439,38±17,82405,63±23,06Р>0,05290,00±24,93248,75±21,67Р<0,05Р<0,05Р<0,05Примечание: А - агрегаты, Д - димеры, М - мономеры, (Fab)₂ - (Fab)₂-фрагменты, Fab+Fc-фрагменты,
АКА - антикомплементарная активность иммуноглобулина.

Таблица 3Характеристика жидких форм препаратов гетерологичного антирабического иммуноглобулина, полученных по заявленному способу и прототипу, в тесте на перемешивание (80 горизонтальных осцилляций в минуту в течение 2 ч)№ п/пПоказателиЗаявляемый способ, М±SD (n=8)Прототип, М±SD (n=8)Р_1,3Р_2,4до обработки (1)после обработки (2)P_1,2до обработки (3)после обработки (4)Р_3,41Молекулярные параметры, %А0,04±0,110,23±0,19Р>0,050,04±0,051,75±0,25Р<0,05Р>0,05Р<0,05Д+М5,21±0,855,61±0,74Р>0,0511,99±1,1611,41±0,71Р>0,05Р<0,05Р<0,05(Fab)₂92,47±1,7290,35±1,02Р>0,0570,86±2,3468,01±1,44Р>0,05Р>0,05Р<0,05Fab+Fc2,28±0,873,81±0,47Р>0,0517,11±0,7318,83±0,80Р<0,05Р<0,05Р<0,052АКА, СН50/мг белка0,11±0,060,20±0,15Р>0,050,16±0,170,60±0,25Р<0,05Р>0,05Р<0,053Специфическая активность, МЕ/мл439,38±17,82426,50±21,09Р>0,05290,00±24,93276,88±16,01Р<0,05Р<0,05Р<0,05Примечание: А - агрегаты, Д - димеры, М - мономеры, (Fab)₂ - (Fab)₂-фрагменты, Fab+Fc-фрагменты.
АКА - антикомплементарная активность иммуноглобулина.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к производству медицинских биологических препаратов. Разработан вирусбезопасный способ получения гетерологичного антирабического иммуноглобулина из высокоспецифичной гетерологичной антирабической сыворотки каприлатно-спиртовым методом с пепсиновой обработкой, который позволяет получить высокоочищенный гетерологичный антирабический иммуноглобулин для внутривенного и внутримышечного введения. При этом в качестве исходного сырья используют высокоспецифичную антирабическую сыворотку, полученную от иммунизации животных-продуцентов очищенным вирусом бешенства, выращенным на культуре клеток Vero или ПСХ. Содержание γ-глобулиновой фракции в препарате составляет не менее 90%, молекулярно-массовое распределение: агрегаты не более 1,0%, димеры и мономеры менее 10,0%, F(ab)₂-фрагменты не менее 84,0%, Fab- и Fc-фрагменты менее 5,0%, низкая антикомплементарная активность, специфическая активность не менее 150 МЕ/мл. Осмолярность готового препарата в пределах 250-350 мОсм/кг. Изобретение обеспечивает получение высокоочищенного гетерологичного антирабического иммуноглобулина, стабильного при хранении и транспортировке. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Способ получения высокоочищенного гетерологичного антирабического иммуноглобулина, включающий выделение γ-глобулиновой фракции этанолом и введение в готовый препарат глицина и натрия хлорида, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют высокоспецифичную антирабическую сыворотку, полученную от иммунизации животных-продуцентов очищенным вирусом бешенства, выращенным на культуре клеток Vero или ПСХ, фракционирование ведут каприловой кислотой с пепсиновой обработкой, которую проводят в присутствии мальтозы 0,5-3,0% и содержании хлоридов 0,2-3,0%, очищают от приместных веществ и вводят вспомогательные вещества в комбинации, обеспечивающей осмолярность готового препарата в пределах 250-350 мОсм/кг.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для фракционирования используют высокоспецифичную антирабическую сыворотку, полученную от иммунизации лошадей, мелкого рогатого скота, свиней.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для фракционирования используют высокоспецифичную гетерологичную антирабическую сыворотку, в которой антитела к клеткам Vero или ПСХ менее 0,5 мкг/мл.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что избыточное содержание натрия хлорида и остаточное содержание каприловой кислоты, пепсина и этанола удаляют диализом, и/или ультрафильтрацией, или ионообменной хроматографией, или активированным углем.5. Способ по п.1, отличающийся тем, что для стабилизации препарата используют мальтозу в концентрации 0,5-3,0%, глицин 0,7-1,5%, натрия хлорид 0,1-0,45%.6. Способ по п.1, отличающийся тем, что готовый препарат получают в жидкой или сухой форме.7. Препарат гетерологичного антирабического иммуноглобулина для внутривенного и внутримышечного введения, полученный способом по п.1, со специфической активностью не менее 150 МЕ/мл, с концентрацией белка в растворе 4,5-10,0%, в котором содержание γ-глобулиновой фракции составляет не менее 90,0%, α- и β-глобулинов менее 9,0%, альбумин менее 1,0%, антикомплементарная активность менее 1,0 СН50/мг белка, имеющий молекулярно-массовое распределение: агрегаты менее 1,0%, димеры и мономеры менее 10,0%, F(ab)₂-фрагменты не менее 84,0%, Fab- и Fc-фрагменты менее 5,0%, антитела к клеткам Vero или ПСХ - менее 0,5 мкг/мл.8. Препарат по п.7, отличающийся тем, что осмолярность препарата находится в пределах 250-350 мОсм/кг.9. Препарат по п.7, отличающийся тем, что препарат имеет величину pH 5,0-7,5.10. Препарат по п.7, отличающийся тем, что препарат может быть в жидкой или сухой форме.