ПРЕПАРАТ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ДИФТЕРИИ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2001 года по МПК A61K39/395 A61K35/16 

Изобретение относится к медицине, в частности иммунологии, и может быть использовано для иммунопрофилактики и иммунотерапии дифтерии.

Традиционным способом лечения дифтерии является внутримышечное введение противодифтерийной сыворотки (ПДС), полученной из крови лошадей, гипериммунизированных дифтерийным анатоксином, содержащей специфические иммуноглобулины, нейтрализующие токсины дифтерийных бактерий. В 1 мл сыворотки содержится не менее 1500 международных антитоксических единиц активности (МЕ). Являясь эффективным способом лечения дифтерии, ПДС обладает рядом недостатков: введение значительного количества чужеродного белка обуславливает возможность развития анафилактических реакций и сывороточной болезни (Фаворова Л.А. и др. Дифтерия. - М.: Медицина, 1988. - С. 187-192).

Известен препарат иммуноглобулина противодифтерийного человека, получаемый из плазмы доноров, вакцинированных дифтерийным анатоксином. В 1 мл препарата содержится от 5 до 50 МЕ противодифтерийных антител. Профилактическая доза препарата 300 МЕ при внутримышечном введении, лечебная - от 1200 до 20000 МЕ (Алешин В.А., Зацепин Ю.К., Башлай А.Г. и др. Получение противодифтерийного иммуноглобулина. // Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине. - Уфа, 1995. - Ч. 1. - С. 100-102).

Однако выпуск противодифтерийного гомологичного иммуноглобулина ограничен недостаточностью сырьевой базы и несовершенством схем иммунизации. Все более ограничивает возможность заготовки донорской крови рост "традиционных" инфекций, передающихся через кровь (сифилис, гепатиты, ВИЧ-инфекция, новые T- и B-лимфотропные вирусы, диагностика которых пока еще затруднена) (Райхер Л. И. , Райхер И.И. Аффинноочищенные ксеногенные антитела. Перспективы развития, проблемы. // Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине. - Уфа, 1995. - Ч. 2. - С. 86-91).

Кроме того, для приготовления одной серии препарата иммуноглобулина противодифтерийного человека требуется кровь не менее чем 1000 доноров, поэтому он представляет собой смесь молекул разного аллотипа, введение которых может приводить к развитию аллергических реакций у больных (Пыцкий В.И., Адрианова Н. В. , Артомасова А.В. Аллергические заболевания. - М.: Медицина. - 1991. - С. 176).

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения гетерогенного сывороточного препарата, включающий в себя обработку сыворотки риванолом, пепсином, гидроокисью алюминия, с последующей ультрафильтрацией и стерилизующей фильтрацией (патент N 2062617, кл. A 61 K 35/16, 39/00, 1996).

Однако данный способ не позволяет получать препараты с высокой степенью очистки: конечный продукт представляет собой комплекс F(ab)₂-фрагментов иммуноглобулинов различной специфичности, причем антитела (антитоксины) против того антигена, которым иммунизировался продуцент, составляют не более 25% от общего содержания белка. Вследствие этого антитоксические сыворотки остаются перегруженными балластными белками и в ряде случаев могут вызывать анафилактические реакции различной степени тяжести со стороны реципиента. Кроме того, препараты контаминированы групповыми веществами крови (ГВК), что может также стать причиной осложнений при введении сывороток.

Технический результат изобретения заключается в получении высокоочищенного противодифтерийного препарата со сниженной реактогенностью из гетерогенного сырья. Препарат для профилактики и лечения дифтерии представляет собой лиофилизированную форму.

Задача решается путем получения препарата для профилактики и лечения дифтерии из ферментированной гипериммунной сыворотки лошади с применением иммунноаффинной очистки.

Сущность изобретения заключается в следующем. Препарат для профилактики и лечения дифтерии представляет собой лиофилизированную монорецепторную фракцию F(ab)₂-фрагментов IgG лошади, выделенную из ферментированной гипериммунной сыворотки лошади с помощью иммуносорбента, содержащего в качестве лиганда очищенный концентрированный дифтерийный анатоксин. Иммунноаффинная очистка позволяет получать высокоочищенный препарат для профилактики и лечения дифтерии с активностью противодифтерийных антител не менее 2500 МЕ/мл и содержанием белка 3-4%.

Полученный препарат является монофракционным, в то время как препарат-прототип имеет ярко выраженные примеси неактивного белка (фиг. 1). Препарат для профилактики и лечения дифтерии является монорецепторным: в реакции двойной иммунодиффузии с дифтерийным анатоксином образует одну линию преципитации, в то время как сыворотка (прототип) - 2-3 линии (фиг. 2).

Характеристика препаратов, полученных по известным способам и предложенным, представлена в табл. 1-3.

Высокая степень очистки и отсутствие ГВК обеспечивают снижение реактогенности препарата для профилактики и лечения дифтерии, полученного из гетерогенного сырья (табл. 1, 2), при этом он обладает высокими протективными свойствами: минимальная доза антитоксина в сыворотках крови 0,03-0,125 МЕ/мл, соответствующая защитному титру при дифтерии, защищает 100% животных от введения 1,8-5,6 LD₅₀ дифтерийного токсина (табл. 3). Лиофильное высушивание позволяет получать высокоактивные сухие дозированные препараты, пригодные для длительного хранения.

Осуществление способа.

Для приготовления препарата для профилактики и лечения дифтерии используют гипериммунную лошадиную сыворотку, для чего ее ферментируют пепсином, осуществляют солевое фракционирование белков и термоденатурацию балластного белка. Выделение целевого продукта из ферментированной гипериммунной сыворотки осуществляют с применением специфического иммуносорбента, содержащего в качестве лиганда очищенный концентрированный дифтерийный анатоксин. Препарат концентрируют с помощью ультрафильтрации на мембранах с порогом задержания веществ по молекулярной массе 100 кД. Стерилизующую фильтрацию проводят на мембранах с диаметром пор 0,22 мкм.

Пример
1. Ферментолиз гипериммунной сыворотки.

30 л гипериммунной лошадиной сыворотки загружают в реактор и разбавляют 60 л апирогенной дистиллированной воды до содержания 3% белка. Вносят при помешивании 243 г пепсина, растворенного в небольшом количестве подкисленной дистиллированной воды. Протеолиз проводят при pH 3,2 при комнатной температуре 1 ч и 1 ч при pH 4,2. (pH доводят до нужного значения 2,5 моль/л раствором соляной кислоты или 2,5 моль/л раствором гидроксида натрия).

По окончании 2-го часа протеолиза в реактор через загрузочный люк добавляют 14,5% сульфата аммония (13 кг), pH доводят до значения 4,3-4,33. Смесь подогревают до 56^oC и выдерживают при этой температуре 45 минут. После этого ферментат освобождают от балластного белка фильтрацией через миткалевые кассетные фильтры. Осадок балластных белков отбрасывают, а прозрачный фильтрат, содержащий белки с антитоксической активностью, собирают и подводят в нем pH до 7,0-7,2.

2. Приготовление моноспецифического иммуносорбента.

Для получения иммуносорбента используют стандартный препарат цианбромированной сефарозы 4В ("Pharmacia, Швеция"), а в качестве специфического лиганда - очищенный концентрированный дифтерийный анатоксин с активностью 450 Lf/мл. 200 г сухой сефарозы заливают двумя литрами 0,001 моль/л раствора соляной кислоты на 30 минут и отмывают от консервантов тем же раствором. 1,2 л дифтерийного анатоксина соединяют с осадком набухшей сефарозы (900 мл), хорошо перемешивают и выдерживают при температуре 4^oC в течение 24 часов. После чего определяют объем надосадочной жидкости (V₁) и титр анатоксина (T₁) в реакции флокуляции. Если титр не превышает 10 Lf/мл, то декантат отбрасывают, в противном случае сорбцию продолжают. Образованный комплекс сефароза - анатоксин отмывают от несвязавшегося белка стерильным апирогенным карбонатно-бикарбонатным буферным раствором pH 9,0 под контролем спектрофотометрии. Последнюю порцию промывных вод после установления нейтрального pH проверяют на пироген по общепринятой методике.

При отсутствии пирогенов в промывных водах свободные активные группы цианбромированной сефарозы блокируют двумя литрами 1 моль/л раствора этаноламина pH 9,0 в течение двух часов в затемненном месте при постоянном помешивании.

Иммуносорбент трехкратно отмывают чередующимися стерильными апирогенными буферными растворами: 2 л ацетатного pH 4,0; 2 л борно-боратного pH 8,0. Промывные воды (V₁) контролируют на наличие дифтерийного анатоксина в реакции флокуляции (T₂). Титр иммуносорбента рассчитывают по формуле

где A - титр иммуносорбента;
V, T - объем и титр анатоксина;
V₁, T₁ - объем и титр надосадочной жидкости;
V₂, T₂ - объем и титр промывных вод;
C - объем иммуносорбента.

Таким образом, получают 900 мл суспензии иммуносорбента с титром 588 Lf/мл.

3. Выделение монорецепторной фракции F(ab)₂-фрагментов IgG лошади, концентрирование препарата.

Для выделения F(ab)₂-фрагментов IgG лошади используют бесколоночный "Batch"-метод. При этом все используемые емкости и растворы должны быть стерильными и апирогенными. Сорбент и ферментированную антитоксическую сыворотку с активностью 110 МЕ/мл соединяют в количествах, эквивалентных по титру

где V_ф, T_ф - объем и титр ферментата,
V_и.с., T_и.с. - объем и титр иммуносорбента.

Т.е. одной порции иммуносорбента достаточно для истощения 4,8 л ферментированной противодифтерийной антитоксической сыворотки.

Сорбцию специфических антител проводят при комнатной температуре в течение 1 ч, pH 7,0. Сорбент отмывают от несвязавшихся белков стерильным апирогенным забуференным физиологическим раствором (ЗФР) pH 7,0 до нулевой отметки по показаниям спектрофотометра. В качестве элюента используют стерильный апирогенный ЗФР, подкисленный до pH 2,2 - 2,4 1 моль/л соляной кислотой.

Экспозиция иммуносорбента в элюенте составляет 10-15 минут. Специфический белок последовательно элюируют порциями ЗФР pH 2,4: 1,5-1,0-0,5 л. Отбирают элюаты с содержанием белка не менее 0,01%, объединяют и доводят pH до 6,8-7,2. Объединенные элюаты проверяют на пироген по общепринятой методике.

Иммуносорбент отмывают от белка ЗФР (pH 7,0) и хранят в стерильном апирогенном борно-боратном буферном растворе (pH 8,0) при температуре 4^oC. Иммуносорбент используют многократно (до 20 раз).

Получают 90 л элюатов с содержанием специфического белка 0,095-0,1%. Концентрирование элюатов проводят методом ультрафильтрации на установке АР-2 с полыми волокнами марки ВПУ-100 под давлением 0,06 ± 0,02 МПа. Процесс концентрирования продолжают до содержания белка в концентрате в пределах 3-4%.

Получают 3 л концентрированных аффинноочищенных F(ab)₂-фрагментов IgG лошади с активностью 2500 МЕ/мл и белком 3%. Очищенный концентрированный антитоксин осветляют с помощью последовательной фильтрации через мембраны с диаметром пор 0,8-0,65-0,45 мкм. Стерилизующую фильтрацию проводят на мембранах с диаметром пор 0,22 мкм. Стерильный препарат для профилактики и лечения дифтерии разливают в ампулы по 1,0 мл.

4. Лиофилизация.

Ампулы с препаратом для профилактики и лечения дифтерии помещают в приемную кассету и ставят на замораживание в низкотемпературный прилавок аппарата ТГ-50, обеспечивающего температуру замораживания не менее минус 38^oC. При принудительной вентиляции препарат замораживают в течение не менее 18 ч, без принудительной вентиляции не менее 20 ч. Загрузка продукта в сублиматор производится по достижении конденсатором температуры не выше минус 50^oC, полок не выше минус 15^oC. После чего сублиматор вакуумируется. Точка размораживания препарата минус 33-36^oC. При достижении препаратом температуры не выше минус 38^oC и стабилизации вакуума не более 9 Па начинают подогрев полок. Через час после загрузки подогрев на 0^oC и далее по 5^oC в час. Конечная температура нагрева полок 34-40^oC. После выдерживания препарата при плюсовой температуре в течение 20 ч сушка считается законченной.

Таким образом, предложенный способ позволяет получать препарат для профилактики и лечения дифтерии со сниженной реактогенностью, обладающий высокими протективными свойствами, в лиофилизированной форме.

Изобретение относится к медицине, в частности иммунологии, и может быть использовано для иммунопрофилактики и иммунотерапии дифтерии. Препарат представляет собой лиофилизированную монорецепторную фракцию F(ab)₂-фрагментов IgG лошади, выделенную из ферментированной гипериммунной сыворотки лошади с помощью иммуносорбента, содержащего в качестве лиганда очищенный концентрированный дифтерийный анатоксин. Иммуноаффинная очистка позволяет получать препарат с активностью противодифтерийных антител не менее 2500 МЕ/мл, с содержанием белка 3-4%. Для приготовления противодифтерийного препарата используют гипериммунную лошадиную сыворотку, для чего ее ферментируют пепсином, осуществляют солевое фракционирование белков и термоденатурацию балластного белка. Выделение целевого продукта из ферментированной гипериммунной сыворотки осуществляют с применением специфической сорбции. Технический результат заключается в получении высокоочищенного противодифтерийного препарата со сниженной реактогенностью. 2 с. и 1 з.п.ф-лы, 3 табл., 2 ил.

1. Препарат для профилактики и лечения дифтерии, содержащий F(ab)₂-фрагменты IgG лошади, отличающийся тем, что он представляет собой монорецепторную фракцию F(ab)₂-фрагментов IgG лошади с активностью противодефтерийных антител не менее 2500 МЕ/мл и содержит в качестве вспомогательного вещества 0,9% раствор хлорида натрия с pH 6,8 - 7,2 при следующем соотношении ингредиентов:
Монорецепторная фракция F(ab)₂-фрагментов IgG лошади с активностью противодифтерийных антител не менее 2500 МЕ/мл - 3 - 4 мас.%
0,9% раствор хлорида натрия с pH 6,8 - 7,2 - До 1 мл
2. Препарат для профилактики и лечения дифтерии по п.1, отличающийся тем, что представляет собой лиофилизированную форму. 3. Способ получения препарата для профилактики и лечения дифтерии, включающий ферментолиз гипериммунной лошадиной сыворотки пепсином, отличающийся тем, что после ферментации осуществляют солевое фракционирование и термоденатурацию белков сыворотки, выделение целевого продукта осуществляют с помощью специфического иммуносорбента, содержащего в качестве лиганда очищенный концентрированный дифтерийный анатоксин, с последующей концентрацией методом ультрафильтрации на мембранах с порогом задержания веществ по молекулярной массе 100 кД, стерилизующей фильтрацией на мембранах с диаметром пор 0,22 мкм.