СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ФОЛЛИКУЛОСТИМУЛИРУЮЩЕГО ГОРМОНА ИЗ АДЕНОГИПОФИЗОВ ЖИВОТНЫХ Российский патент 1996 года по МПК A61K38/24 

Изобретение относится к биологии, в частности к получению препаратов, используемых в животноводстве и ветеринарной медицине с целью стимуляции половой функции, вызывания суперовуляции для трансплантации эмбрионов, а также при эндокринных нарушениях у самок сельскохозяйственных животных.

Известен способ получения фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) из мочи женщин в период менопаузы путем сорбции на смеси каолина и кизельгура с последующим элюированием растворами солей аммония [1] Известен также способ получения препарата ФСГ из гипофизов лошадей [2] который включает следующее основные этапы: измельчение железы, экстракцию этанолом, осаждение ацетоном, диализацию против хлорида натрия, осаждение метафосфорной кислотой, центрифугирование, гельфильтрацию на сефадексе G-100, хроматографию на карбоксиметилсефадексе, препаративный электрофорез в полиакриламидном геле, рехроматографию и стандартизацию препарата.

Однако первый способ, вследствие низкого содержания ФСГ в моче животных, для получения гормонального препарата не пригоден, а многоэтапность и сложность технологического процесса с использованием дефицитного оборудования и реактивов второго способа делает его длительным, дорогостоящим и приводит к снижению выхода препарата.

В качестве прототипа выбран способ получения ФСГ из гипофизов животных [3] который включает гомогенизацию железистой ткани, экстракцию и очистку гормона путем дифференцированного растворения его в растворах сернокислого аммония нисходящих концентраций. Используя для этой цели сернокислый аммоний 40, 56, 58 и 80-ной концентрации.

Недостатком этого способа является то, что применение для очистки гормона дифференцированного растворения в растворах сернокислого аммония разных концентраций не позволяет полностью освободиться от балластных белков, что приводит к потерям препарата и снижению его биологической активности.

Перед гомогенизацией аденогипофизы, полученные от животных, заливают буферным раствором с рН 7,0-7,5 в соотношении 1:6-7 и который включает 0,89-0,90% натрия хлорида, 3,2-3,4% сернокислого аммония, 10-15% этилового спирта и 0,14-0,15% йодида калия. Данную смесь гомогенизируют в течение 2-4 минут при температуре 2-4^oС до получения однородной массы. Затем гомогенизат экстрагируют в течение 50-60 минут при 2-4^oC. При увеличении времени гомогенизации, экстракции и повышении температуры происходит активизация протеолитических ферментов, а при уменьшении времени гомогенизации, экстракции и понижении температуры снижается дезагрегация клеточной ткани. Как в первом, так и во втором случае происходит уменьшение выхода гормона из тканей в жидкую среду. Прибавление сернокислого аммония, этилового спирта и йодида калия способствует дезагрегации клеточной ткани и более полному переходу гормона в жидкую фазу.

Для освобождения смеси от балластных веществ проводят центрифугирование до расслоения жидкости с образованием плотного осадка. В надосадочную жидкость (фугат) для осаждения сопутствующих белков и других гормонов гипофиза вносят сернокислый аммоний до 35-40% от насыщения и вновь центрифугируют до образования плотного осадка. Полученный фугат с целью освобождения от сернокислого аммония и концентрирования гормона подвергают ультрафильтрации на мембране УАП-200 под давлением. Затем сконцентрированный гормон очищают методом ионообменной хроматографии. Для этого катионит КУ-2 перемешивают со сконцентрированным раствором гормона в течение 50-60 минут до полного их связывания, переносят на мембрану и отмывают от балластных белков физиологическим раствором с рН 4,2 до тех пор, пока в промывной жидкости не будет содержаться белка, наличие которого контролируют спектрофотометрически. Данная среда является оптимальной для связывания катионита с гормоном. При смещении рН в сторону увеличения или уменьшения взаимодействия гормона с катионитом не происходит. "Снимают" гормон с катионита буферным раствором с рН 8,5-9,0, что позволяет наиболее полно отделить гормон от катионита. В результате получают препарат ФСГ с биологической активностью 45-50 м.е. в 1 мл.

В условиях мясокомбината у крупного рогатого скота отбирали гипофизы, отделяли их переднюю долю (аденогипофизы) и замораживали в жидком азоте. К 100 г замороженных аденогипофизов приливали 700 мл буферного раствора с рН 7,0 и содержащего 6,3 г натрия хлорида, 23,8 г сернокислого аммония, 70 мл этилового спирта, 1 г йодида калия и гомогенизировали в течение 3 минут при температуре 2-4^oC до получения однородной массы. Полученный гомогенизат экстрагировали в течение 60 минут при температуре 2-4^oС. После этого грубую взвесь тканей осаждали центрифугированием при температуре 2-4^oС до расслоения жидкости с образованием плотного осадка. В полученный фугат, для освобождения от сопутствующих белков и других гормонов гипофиза, вносили сернокислый аммоний до 40% от насыщения и вновь центрифугировали в том же режиме. Полученный фугат, с целью освобождения от сернокислого аммония и концентрирования гормона, подвергали ультрафильтрации на мембране УАП-200 под давлением. Сконцентрированный гормон очищали методом ионообменной хроматографии на катионите КУ-2. Для этого катионит предварительно обрабатывали в небольшом количестве физиологического раствора с рH 4,2 и затем прибавляли к нему сконцентрированный раствор гормона. Смесь перемешивали в течение 60 минут до полного связывания с катионитом. После этого катионит со связанным гормоном переносили на мембрану и отмывали от балластных селков физиологическим раствором с рН 4,2, до тех пор пока в промывной жидкости белок не обнаруживался. Отделяли гормон от катионита буферным раствором с рН 8,5-9,0. В результате очистки получали образец ФСГ объемом 300 мл с биологической активностью 45-50 м.е. в 1 мл.

Конечный продукт представлял собой прозрачную жидкость без запаха и примесей. После концентрации препарата и стандартизации в соответствии с препаратом ФСГ-п (фирмы Schering Corporation, США) он был расфасован в стеклянные ампулы, которые герметично запаивались. Для проверки препарата на токсичность использовали белых мышей и морских свинок, согласно существующим методическим указаниям. Все подопытные животные после введения препарата были живы.

Для производственного испытания изготовленного препарата ФСГ были проведены научно-производственные эксперименты. С этой целью в условиях учебно-опытного хозяйства Курского СХИ по принципу аналогов было отобрано 30 клинически здоровых коров черно-пестрой породы. Из отобранных животных сформировали три группы по 10 голов в каждой. Первую группу подвергали обработке изготовленным препаратом ФСГ, вторую группу стимулировали препаратом-прототипом, третью группу обрабатывали препаратом ФСГ-п (фирмы Schering Corporation, серия 594М89). Все препараты использовали с 8-го дня полового цикла по 5-дневной схеме в сочетании с простагландиновым препаратом эстрофаном (500 мкг). При этом дозировка как испытуемого препарата, так и препарата-прототипа соответствовала по общей активности 50 мг американского ФСГ-п. Hа 13-14 день полового цикла у отобранных коров выявляли охоту с использованием быка-пробника и искусственно осеменяли. На 20-й день полового цикла осуществляли нехирургическое извлечение эмбрионов и проводили их оценку согласно методическим указаниям (Москва-Быково, Госагропром, 1989 г.).

Результаты исследований представлены в таблице 1, анализ которой показывает, что изготовленный препарат ФСГ по своей биологической активности значительно превосходит препарат-прототип. Таким образом, представленный технологический процесс получения препарата ФСГ из гипофизов животных является не сложным, не требует дорогостоящего оборудования и дефицитных реактивов, а полученный при этом препарат не вызывает побочных действий и обладает высокой биологической активностью. ТТТ1

Использование: биология, в животноводстве и ветеринарии. Сущность: способ включает гомогеммнацию аденогипофизов животных, экстракцию, осаждение балластных белков и выделение гормона. Аденогипофизы животных гомогенизируют при 2-4 град. С в присутствии буферного раствора с рН 7,0-7,5 в соотношении 1: 6-7. Полученный гомогенизат экстрагируют в течение 50 - 60 минут при 2-4 град. С и центрифугируют до расслоения жидкости с образованием плотного осадка. Для освобождения фугата от балластных белков в него вносят сернокислый аммоний до 35-40 проц. от насыщения и вновь центрифугирую в том же режиме. Полученный фугат подвергают ультрафильтрации под давлением, и сконцентрированный гормон очищают методом ионообменной хроматографии с последующей очисткой на мембране физиологическим раствором с рН 4,2-4,5 и отделением его от катионита буферным раствором с рН 8,5-9,0. 1 табл.

Способ получения препарата фолликулостимулирующего гормона из аденогипофизов животных, включающий гомогенизацию, экстракцию, осаждение балластных белков и выделение гормона, отличающийся тем, что гомогенизацию осуществляют при 2 4^oC в присутствии буферного раствора с рН 7,0 7,5 в соотношении 1:6 1: 7, который включает 0,89 0,90% натрия хлорида, 3,2 - 3,4% сернокислого аммония, 10 15% этилового спирта, 0,14 0,15% йодида калия, остальное дистиллированная вода, экстракцию проводят в течение 50 - 60 мин при 2 4^oC, осаждение балластных белков осуществляют путем центрифугирования экстракта до расслоения жидкости с образованием плотного осадка, затем добавляют сернокислый аммоний до 35 40% от насыщения и вновь центрифугируют, а выделение гормона осуществляют путем ультрафильтрации под давлением и очистки методом ионообменной хроматографии с последующей очисткой на мембране физиологическим раствором с рН 4,2 4,5 и отделением от катионита буферным раствором с рН 8,5 9,0.