СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТОХРОМА С Российский патент 2014 года по МПК C12P21/00 C07K14/80 

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, к области получения лекарственных белковых препаратов, а именно к способу получения цитохрома С из мышц сердца млекопитающих - свиней, крупного рогатого скота и лошадей.

Цитохром С представляет собой фермент с молекулярной массой около 12700 Да, в качестве простетической группы содержит гематом железа, катализирует окислительно-восстановительные реакции и служит переносчиком электронов (Ю.А. Овчинников. Биоорганическая химия. М.: Химия, 1987, с.815).

Цитохром С широко используется в медицине и ветеринарии в качестве лекарственного препарата, а также в виде реактива в биохимии и биотехнологии.

Изобретение может использоваться при получении цитохрома С в промышленных масштабах.

Цитохром С может быть выделен из разнообразных видов природного сырья: дрожжей, риса, мышц сердца млекопитающих (лошадей, крупного рогатого скота, свиней, собак, кроликов, человека), птиц (голубей, пингвинов), сердец лососевых и других. Известны способы получения цитохрома С, включающие выделение из мышц сердца млекопитающих, предпочтительно крупного рогатого скота, путем экстракции и сорбционной очистки экстракта с использованием алюмосиликата магния (F. Okumura and al. Chem. Soc. Japan. V.49, №1, p.65, 1975) или карбоксильных катионитов типа Амберлит ХЕ - 64 (В. Hagihara and al. J. Biochem. V. 45, №8, p.551, 1975) и КМДМ (Л.К. Шатаева, H.H. Кузнецова, Г.Э. Елькин. Карбоксильные катиониты в биологии. Л.: Наука, 1979, с.285).

Данные сорбенты характеризуются малой емкостью и сложностью при промышленном применении, особенно карбоксильных катионитов из-за разницы в степени набухания в H⁺ и Na⁺-форме.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения цитохрома С из мышц сердца млекопитающих - свиней, крупного рогатого скота и лошадей (Патент RU 2435597, опубл. 10.12.2011, бюл. №34), включающий обезжиривание сердец свиней крупного рогатого скота или лошадей, удаление из них связок и сосудов, измельчение и экстракцию 2,5% раствором кислоты трихлоруксусной при температуре 10-15°C, при pH 3,9-4,2, отделение экстракта от фарша. Сорбцию целевого продукта проводят непосредственно из отфильтрованного экстракта при pH экстракта на катионите UNOsphere™ S, уравновешенном стартовым буферным раствором, содержащий 2 мМ лимонной кислоты и 1,5 мМ трис (трис (гидроксиметил) аминометан) при pH 3,9-4,2, после завершения сорбции катионит промывают стартовым буферным раствором, балластные белки удаляют с катионита UNOsphere™ S 80 мМ раствором трис и затем проводят элюцию цитохрома С раствором сульфата аммония с концентрацией 0,3 М, после стадии элюции осуществляют осаждение балластных белков путем добавления сухого сульфата аммония из расчета 0,270 г\мл.

В прототипе используют катионит UNOsphere™ S (UNOsphere Polymer Technology, производства «Bio-Rad» USA) - имеющий в качестве функциональных групп - SO₃-группы.

Недостатком указанного способа получения цитохрома С является невысокая степень чистоты цитохрома С, показатель чистоты (E_550\280) цитохрома С в элюате (отношение экстинкции раствора цитохрома С при длине волны 550 нм и раствора цитохрома С при длине волны 280 нм) составляет 0,92-0,93, что требует для осаждения балластных белков из элюата использование повышенного количества сульфата аммония (0,27 г\мл), также к существенным недостаткам указанного способа получения цитохрома С является использование растворов, в состав которых входят дорогостоящие реактивы, такие как лимонная кислота и трис(гидроксиметил) аминометан. Вышеуказанные недостатки значительно сокращают эффективность и экономичность технологического процесса.

Таким образом, задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ получения цитохрома С из экстракта с использованием катионитов нового поколения, обеспечивающих высокую емкость сорбции и обратимость сорбции с применением недорогих реактивов, обеспечивающих высокую степень чистоты целевого продукта, что делает их наиболее предпочтительными при использовании в промышленных масштабах.

Техническим результатом настоящего изобретения является: увеличение емкости по целевому продукту, повышение степени чистоты цитохрома С, сокращение технологического процесса.

Согласно настоящему изобретению предложен сорбционный способ получения цитохрома С из экстракта с использованием катионита нового поколения Nuvia™ S (Nigh - Capacity Cation Exchange Media, производства «Bio-Rad» USA) - содержащий в качестве функциональных групп - сульфогруппы. На заключительных стадиях получения цитохрома С применяют диафильтрацию (для удаления ионов сульфата аммония) и ультрафильтрацию (для концентрирования цитохрома С) в тангенциальном потоке на мембранах с пределом исключения по молекулярной массе 5 кДа фирмы Millipore или Sartorius.

Для достижения указанного технического результата предложен способ, который включает в себя следующие стадии:

Из сердец свиней, крупного рогатого скота или лошадей после обезжиривания и удаления из них связок, сосудов, путем измельчения получают фарш. Полученный фарш экстрагируют 2,5% раствором кислоты трихлоруксусной при температуре 10-15°C, при pH 3,9-4,2. После отделения от фарша непосредственно ведут сорбцию целевого продукта из отфильтрованного экстракта на катионите Nuvia™ S, катионит предварительно уравновешивают дистиллированной водой. После завершения сорбции катионит Nuvia™ S промывают дистиллированной водой. Удаление балластных белков с колонки проводят 0,075 М аммиачно-аммонийным буферным раствором pH=10,5. Элюцию цитохрома C с катионита Nuvia™ S проводят раствором сульфата аммония с концентрацией 0,25 М. Для отделения цитохрома С от сульфата аммония проводят диафильтрацию в тангенциальном потоке на мембранах с пределом исключения 5 кДа, на этих же мембранах ультрафильтрацией осуществляют концентрирование цитохрома С.

Для уравновешивания и промывки колонки наиболее оптимальной является дистиллированная вода. Для удаления балластных белков с катионита оптимальным является 0,075 М аммиачно-аммонийный буферный раствор pH=10,5, при более низких концентрациях и pH буферного раствора не полностью вымываются балластные белки, более высокие концентрации и pH не оказывают существенного влияния на количество удаленных балластных белков. Для элюции цитохрома C с катионита наиболее оптимальным является раствор сульфата аммония с концентрацией 0,25 М, низкие концентрации сульфата аммония не полностью элюируют целевой продукт с катионита, при более высоких концентрациях с катионита частично элюируются примесные белки, что существенно снижает степень чистоты целевого продукта.

Использование катионита Nuvia™ S позволяет непосредственно вести сорбцию цитохрома С из экстракта (при pH экстракта), использовать меньший объем катионита за счет большей его емкости, существенно повысить степень чистоты цитохрома С. Повышение степени чистоты цитохрома С на стадии десорбции с катионита Nuvia™ S делает возможным исключение стадии осаждения балластных белков, что значительно повышает эффективность и экономичность технологического процесса как за счет уменьшения расхода реактивов, так и за счет сокращения времени проведения процесса.

Настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

2,6 кг фарша, полученного из сердечных мышц свиней после удаления сосудов, связок и измельчения, отмывают водой от остатков крови, экстрагируют 2,5% кислоты трихлоруксусной. Экстракцию ведут 2 ч при 10-15°C. Экстракт отделяют от исходного сырья фильтрованием через ватно-марлевый фильтр с последующим центрифугирование при n=3000 об\мин в течение 10 мин. pH полученного экстракта 4,1. Всего получают 2750 мл экстракта. Полученный экстракт пропускают через катионит Nuvia™ S, уравновешенным дистиллированной водой. Объем колонки 49 мл (диаметр 2,5 см, высота слоя сорбента 3,8 см, количество сорбента 19 мл). Сорбцию ведут при скорости пропускания раствора 2240 мл/ч. Время сорбции около 1,2 ч. Затем катионит Nuvia™ S промывают 200 мл дистиллированной воды. Время промывки 0,09 ч. Для удаление балластных белков с колонки пропускают 400 мл 0,075 М аммиачно-аммонийный буферный раствор pH=10,5 при скорости 750 мл\час. Время промывки 0,53 ч.

Элюцию цитохрома С проводят раствором сульфата аммония с концентрацией 0,25 М. Скорость подачи элюирующего раствора 75 мл/ч. Время элюции 0,5 ч. Элюат отбирают фракциями. Фракции, окрашенные в красный цвет, объединяют. Объем фракций около 25 мл. Показатель чистоты цитохрома С (E_550\280) составляет 1,15. Выход 245 мг цитохрома С или 94,6 мг\кг исходного сырья.

Пример 2.

Выполняется в условиях примера 1. Для отделения цитохрома С от ионов сульфата аммония проводят диафильтрацию. Для этого раствор цитохрома С в количестве 125 мл (объединенные фракции 5^х загрузок) пропускают на ультрафильтрационной установке в режиме диафильтрации в тангенциальном потоке через мембраны фирмы Millipore (кассета типа Pellicon XL) или Sartorius (кассета типа Vivaflow 50) с пределом исключения по молекулярной массе 5 кДа. Собирают 135 мл раствора, содержащий целевой продукт.

Показатель чистоты цитохрома С (E_550\280) - 1,24. Выход 232 мг цитохрома С или 89,2 мг\кг исходного сырья (в пересчете на одну загрузку).

Пример 3.

Выполняется в условиях примера 1 и 2. Цитохром С после диафильтрации концентрируют методом ультрафильтрации. 135 мл раствор цитохрома С (объединенные фракции 5^x загрузок после диафильтрации) пропускают на ультрафильтрационной установке в тангенциальном потоке через мембраны фирмы Millipore (кассета типа Pellicon XL) или Sartorius (кассета типа Vivaflow 50) с пределом исключения по молекулярной массе 5 кДа. Получают 45 мл раствора, содержащий целевой продукт.

Показатель чистоты цитохрома С (E_550\280) - 1,26. Выход 225,7 мг цитохрома С или 86,8 мг\кг исходного сырья (в пересчете на одну загрузку).

Примеры 4-9 по стадиям выполнены в условиях примера 1, 2 и 3. Все экспериментальные данные представлены в таблице.

При этом индекс А означает сырье из сердечных мышц свиньи по примеру 1, 2 и 3;

Б - сырье из сердечных мышц крупного рогатого скота; В - сырье из сердечных мышц лошади.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения цитохрома С. Способ предусматривает обезжиривание сердец свиней, крупного рогатого скота или лошадей. Подготовленное сырье измельчают с получением фарша, затем экстрагируют 2,5% раствором трихлоруксусной кислоты при температуре 10-15^°С и рН 3,9-4,2. Отделяют экстракт и осуществляют его сорбцию на катионите Nuvia™ S, уравновешенном дистиллированной водой. После завершения сорбции катионит Nuvia™ S промывают дистиллированной водой и аммиачно-аммонийным буферным раствором. Затем проводят элюцию цитохрома C с катионита Nuvia™ S раствором сульфата аммония с последующей очисткой его диафильтрацией до полного удаления ионов сульфата аммония и концентрированием цитохрома С ультрафильтрацией. Изобретение позволяет увеличить выход продукта, повысить его чистоту и сократить технологический процесс. 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 3 пр.

1. Способ получения цитохрома С, включающий обезжиривание сердец свиней, крупного рогатого скота или лошадей, удаление из них связок и сосудов, измельчение и экстракцию 2,5% раствором кислоты трихлоруксусной при температуре 10-15°C, при pH 3,9-4,2, отделение экстракта от фарша, сорбцию и элюцию на катионите, удаление балластных белков, концентрирование и очистку диафильтрацией и ультрафильтрацией до полного удаления ионов сульфата аммония, отличающийся тем, что сорбцию целевого продукта проводят непосредственно из отфильтрованного экстракта при pH экстракта на катионите Nuvia™ S, уравновешенном дистиллированной водой, после завершения сорбции катионит промывают дистиллированной водой, балластные белки удаляют с катионита Nuvia™ S 0,075 М аммиачно-аммонийным буферным раствором рН 10,5 и затем проводят элюцию цитохрома C с катионита Nuvia™ S раствором сульфата аммония с концентрацией 0,25 М.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что очистку цитохрома С от ионов сульфата аммония проводят диафильтрацией в тангенциальном потоке через мембраны с пределом исключения по молекулярной массе 5 кДа.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрирование цитохрома С проводят ультрафильтрацией в тангенциальном потоке через мембраны с пределом исключения по молекулярной массе 5 кДа.